Bacterias gram negativas resistentes a los antibióticos y patógenas transmitidas a través de vegetales frescos

• Autores: Alberto Pintor Cora
• Directores de la Tesis: Jesús Ángel Santos Buelga (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de León ( España ) en 2024
• Idioma: español
• Número de páginas: 194
• Títulos paralelos:
  • Gram-negative antibiotic resistant and pathogenic bacteria diseminated through fresh produce
• Tribunal Calificador de la Tesis: Teresa María López Díaz (presid.), Jerónimo Rodríguez Beltrán (secret.), Carlos Rodríguez Osorio (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: BULERIA
• Resumen
  • español

    Los vegetales frescos son productos poco monitorizados desde el punto de vista de la presencia de bacterias patógenas y, especialmente antibiorresistentes. Aunque escasa, la información disponible señala a estos productos como posibles reservorios de importancia de bacterias con este carácter. Su frecuente consumo en crudo supone, además, una fuente de preocupación añadida por la exposición directa del consumidor a los microorganismos presentes en los mismos. En el actual contexto de crisis de antibióticos, es crucial evaluar si los vegetales frescos pueden constituir vías silenciosas de diseminación de aislados resistentes a antibióticos y patógenos oportunistas.

    En esta tesis se evalúa la calidad microbiológica general de los vegetales frescos, así como la presencia de aislados -lactamasas tipo ESBL y AmpC (BlAmpC), o carbapenemasas; resistentes a colistina y pertenecientes a los patotipos de E. coli (Capítulo 1). Para ello, se recogieron 145 muestras de vegetales frescos y 90 muestras del entorno de producción en las que se cuantificó la carga de enterobacterias mediante recuento en superficie. Además, un enriquecimiento de estas muestras fue sembrado por agotamiento en medios cromogénicos para la selección de aislados productores de ESBL, BlAmpC, carbapenemasas y la especie E. coli. Aquellas colonias que mostraron la morfología deseada fueron seleccionadas, identificadas mediante MALDI-TOF y caracterizadas respecto de su producción de -lactamasas y resistencia a la colistina.

    Los recuentos de enterobacterias ofrecieron interesantes resultados mostrando diferencias entre las categorías de vegetales de hoja y raíz, con recuentos significativamente superiores a los mostrados por los vegetales de fruto. En cuanto al porcentaje de muestras positivas a aislados productores de -lactamasas, la prevalencia global de ESBL en vegetales fue del 12,4 %, mientras que para los aislados productores constitutivos de BlAmpC fue del 7,6 %. Los productos de hoja, por lo general, mostraron valores de prevalencia de estos aislados superiores a los observados en la zanahoria o los frutos. Respecto del entorno de producción el agua de riego presentó elevados valores de prevalencia tanto de aislados ESBL (12,5 %) como cAmpC (33,0 %) lo que sugiere su actuación como reservorio de estas bacterias en el entorno agrícola.

    Dentro de los aislados productores de ESBL se observó una predominancia de las especies ambientales Serratia fonticola y Rahnella aquatilis. Las cepas de estas especies fueron caracterizadas (Capítulo 2) en función de su susceptibilidad a un panel de antibióticos encontrando 5 aislados de S. fonticola con un patrón de multirresistencia a diferentes categorías de antibióticos. La caracterización genética de las enzimas ESBL mediante amplificación por PCR y secuenciación dio lugar a la identificación de la enzima blaFONA5 en tres aislados de S. fonticola y blaRAHN2 en 2 aislados de R. aquatilis. Aunque estas enzimas están codificadas de manera natural en el cromosoma de estas especies, la movilización de los genes de la familia FONA de S. fonticola a aislados clínicos ha sido previamente reportada, por lo que su papel como reservorio de determinantes ESBL puede ser relevante.

    Las metodologías que permitan la detección rápida de aislados productores de ESBL resultan un aspecto crucial en entornos clínicos, las cuales poseen, además, un elevado potencial para permitir la adquisición de datos a gran escala en estudios ambientales. Una técnica prometedora con este propósito es la espectrometría de masas MALDI TOF, la cual fue validada frente a una colección de 161 aislados bacterianos de orígenes clínicos y ambientales (Capítulo 3). Para ello, los aislados fueron incubados en presencia de cefotaxima durante 30 minutos. El establecimiento de la relación entre la intensidad de los picos de masas asociados a la hidrólisis y no hidrólisis del antibiótico (LogRQ) permitió establecer un valor umbral NLogRQ > 0,210 que clasificaba correctamente todos los aislados ESBL incluidos, lo que demuestra la excelente sensibilidad del método.

    En cuanto a los aislados productores de BlAmpC, estos resultaron más diversos incluyendo principalmente géneros portadores naturales de estas enzimas: Citrobacter, Enterobacter y Aeromonas. Dentro de este grupo las implicaciones clínicas asociadas al complejo Enterobacter cloacae (ECC, Capítulo 4) y al género Aeromonas (Capítulo 5) dieron lugar a una caracterización más exhaustiva de estos grupos bacterianos respecto de sus mecanismos de resistencia a antibióticos y su patogenicidad.

    Ambos grupos de aislados fueron sometidos a paneles de antibióticos que incluían agentes de diferentes familias; estableciendo, además, el valor de MIC frente aquellos antibióticos a los que observaron patrones resistencia. Asimismo, se realizaron ensayos in vitro para determinar su potencial patógeno mediante la infección de diferentes líneas celulares y microscopía confocal. En el caso de Aeromonas, el potencial patógeno fue también estudiado mediante ensayos in vivo en larvas de Galleria mellonella. Las bases genéticas tras la resistencia a los antibióticos y la patogenicidad mostrada por los aislados fueron estudiadas mediante la secuenciación del genoma completo.

    Algunos de los aislados del ECC mostraron importantes patrones de resistencia a las cefalosporinas de tercera e, incluso, cuarta generación y a la colistina. Este patrón de resistencia a colistina fue asociado al gen mcr-9.1. en el aislado E. kobei AG07E, el cual fue confirmado como transmisible mediante conjugación. En cuanto a su potencial patógeno, 3 aislados del ECC mostraron capacidad adherirse a células de colón humano y/o fibroblastos. El caso de E. kobei ZA03E resultó especialmente llamativo, dado que presentó un patrón muy de adherencia muy pronunciado a ambos tipos celulares. Tanto E. kobei AG07E (ST56) como E. kobei ZA03E (ST125) pudieron ser relacionados con aislados de entornos clínicos y de producción animal por medio de su sequence type (ST).

    En cuanto a las cepas de Aeromonas, dos de ellas: A. dhakensis AG29E1 y A.

    salmonicida CI21E, aisladas de una muestra de cilantro y una de agua de riego, mostraron un elevado poder citotóxico frente a células de colon humano, células vero, fibroblastos de ratón e incluso frente macrófagos. Asimismo, estas dos cepas de Aeromonas mostraron una letalidad en las larvas de G. mellonella superior al resto de aislados de estudio en todas las dosis ensayadas. La citotoxicidad en el caso de A. dhakensis AG29E1 se presentó en conjunción con resistencia a cefalosporinas de tercera generación y la colistina, lo que incrementa la alerta sobre la transmisión de este tipo de aislados por su posible implicación en infecciones. Estos resultados son indicativo de la potencial amenaza para la salud pública que supone la transmisión de cepas de Aeromonas por medio de vegetales frescos.

  • English

    Fresh produce has traditionally been less monitored for the presence of pathogenic bacteria and antibiotic-resistant strains. Information on this matter is scarce, and available data suggests that these products could be significant reservoirs of bacteria with such characteristics. Moreover, vegetables are often eaten raw, exposing consumers directly to the microorganisms. In the current context of the antibiotic crisis, the lack of proper monitoring of vegetables might contribute to a silent spread of these resistant strains, posing a serious threat to public health.

    This thesis assesses the overall microbiological quality of fresh vegetables and the presence of isolates producing -lactamases, including ESBL and AmpC (Chapter 1), as well as carbapenemases, strains resistant to colistin and pathogenic E. coli. To achieve this, 145 samples of fresh vegetables and 90 samples from the production environment were collected. First of all, enterobacterial load was evaluated through plate counting.

    Additionally, an enrichment of these samples was cultured using chromogenic media to select isolates producing ESBL, AmpC, carbapenemases, and E. coli. Colonies displaying the desired characteristics were selected, identified by MALDI-TOF and characterized regarding their -lactamase production and resistance to colistin.

    Enterobacteriaceae counts showed significant differences, with leafy and root vegetables exhibiting counts significantly higher than those in fruit vegetables. The overall prevalence of ESBL in vegetables was 12.4 %, while for constitutive BlAmpCproducing isolates, it was 7.6 %. In general, higher values were observed among leafy products compared to carrots or fruit vegetables. Concerning the production environment, irrigation water showed high prevalence values for both ESBL (12.5 %) and cAmpC (33.0 %) isolates, suggesting its role as a reservoir for these bacteria in the agricultural environment.

    Among ESBL-producing isolates, there was a predominance of environmental species Serratia fonticola and Rahnella aquatilis. Strains of these species were characterized (Chapter 2) based on their susceptibility to several antibiotics, revealing five S. fonticola isolates with multidrug-resistant patterns. Genetic characterization of ESBL enzymes by PCR amplification and sequencing identified the blaFONA5 enzyme in three S. fonticola isolates and blaRAHN2 in 2 R. aquatilis isolates. Although these enzymes are naturally encoded in the chromosome of these species, the mobilization of FONA family genes from S. fonticola to clinical isolates has been reported, highlighting their potential role as reservoirs of ESBL determinants.

    Methods that allow for the rapid detection of ESBL-producing isolates are a crucial aspect in clinical settings and have a high potential for acquiring large-scale data in environmental studies. A promising technique for this purpose is MALDI-TOF mass spectrometry, which was validated against a collection of 161 bacterial isolates from clinical and environmental origins (Chapter 3). For this, isolates were incubated in the presence of cefotaxime for 30 minutes. Establishing a threshold value of NlogRQ > 0.210 based on the relationship between the intensity of mass peaks associated with antibiotic hydrolysis and non-hydrolysis accurately classified all included ESBL isolates, highlighting the method's excellent sensitivity.

    Regarding BlAmpC-producing isolates, these were more diverse, mainly including genera naturally carrying these enzymes such as Citrobacter, Enterobacter, and Aeromonas. Within this group, the clinical implications associated with the Enterobacter cloacae complex (ECC, Chapter 4) and the genus Aeromonas (Chapter 5) led to a in deep characterization of these bacterial groups regarding their antibiotic resistance mechanisms and pathogenicity.

    Antibiotic susceptibility Testing was performed for both groups of isolates, including agents from different families, and the MIC value was established for those antibiotics to which resistance patterns were observed. In vitro assays were also conducted to determine their potential pathogenicity by infecting different cell lines and using confocal microscopy.

    In the case of Aeromonas, potential pathogenicity was also studied through in vivo assays in Galleria mellonella larvae. The genetic basis for antibiotic resistance and pathogenicity shown by the isolates was studied through whole genome sequencing.

    Some ECC isolates showed significant resistance patterns to third and even fourth generation cephalosporins and colistin. The colistin resistance pattern observed in E. kobei AG07E isolate was associated with the mcr-9.1 which was confirmed as transferable through conjugation. Regarding their potential pathogenicity, three ECC isolates showed ability to adhere to human colon cells and/or fibroblasts. Isolate E. kobei ZA03E was particularly noteworthy, as it exhibited a highly pronounced adherence pattern to both cell types. Both E. kobei AG07E (ST56) and E. kobei ZA03E (ST125) could be related to isolates from clinical and animal production environments through their sequence type (ST).

    As for Aeromonas strains, A. dhakensis AG29E1 and A. salmonicida CI21E, isolated from coriander and an irrigation water sample, respectively, showed high cytotoxicity against human colon cells, vero cells, mouse fibroblasts, and even macrophages.

    Additionally, these Aeromonas strains exhibited much higher lethality in G. mellonella in the case of A. dhakensis AG29E1 occurred in combination with resistance to third generation cephalosporins and colistin, increasing awareness about the transmission of these isolates due to their potential involvement in infections. These results indicate the potential public health risk posed by the transmission of Aeromonas strains through fresh vegetables.