Aplicación de nuevas técnicas moleculares al estudio de alteraciones cromosómicas en abortos espontáneos

• Autores: Dan Diego Álvarez
• Directores de la Tesis: Isabel Lorda Sánchez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
• Idioma: español
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
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• Resumen

  • ÍNDICE.................................................................................. 1 1 INTRODUCCIÓN .......................................................................... 5 1.1 El aborto espontáneo y sus causas ........................................... 6 1.2 Antecedentes y situación actual del estudio cromosómico de abortos espontáneos ................... 15 1.3 Técnicas moleculares para la detección de anomalías cromosómicas ................................. 16 1.3.1 QF-PCR (Quantitative Fluorescent - Polymerase Chain Reaction) ................................ 16 1.3.2 CGH (Comparative Genomic Hybridization) ................................................................... 18 1.3.3 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ............................................. 20 1.3.4 Array based CGH .................................................................. 23 2 OBJETIVOS ........................................................................ 24 3 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................ 26 3.1 Naturaleza y origen de las muestras empleadas en el presente estudio ............................. 27 3.2 Estudio citogenético .............................................................. 29 3.2.1 Procesamiento de los restos abortivos para la realización del cariotipo ......................... 29 3.2.1.1 Cultivo ................................................................. 29 3.2.1.2 Sacrificio ......................................................................... 30 3.2.1.3 Extensión ......................................................................... 30 3.2.1.4 Obtención de patrón de bandas G para realización del cariotipo ......................... 30 3.2.1.5 Visualización al microscopio y cariotipado ............................ 31 3.3 Estudio molecular de alteraciones cromosómicas ........................ 31 3.3.1 Extracción de ADN ............................................................... 31 3.3.1.1 Extracción de ADN a partir de restos abortivos (QIAamp DNA Blood Mini Kit) .... 31 3.3.1.2 Extracción de ADN con el BioRobot EZ1 .......................... 32 3.3.2 Técnicas moleculares .......................................................... 33 3.3.2.1 QF-PCR .......................................................................... 33 3.3.2.1.1 Detección de alteraciones cromosómicas numéricas: ensayo de validación.......................................................... 33 3.3.2.1.2 Detección de mosaicismos cromosómicos .......................... 39 3.3.2.1.2.1 Mosaicismos numéricos en un mismo tejido ................... 39 3.3.2.1.2.2 Mosaicismos numéricos confinados a un tejido ................. 39 3.3.2.1.3 Diagnóstico de molas hidatidiformes .................................. 40 3.3.2.1.4 Determinación del origen parental y meiótico / mitótico de la aneuploidía ................................................ 40 3.3.2.2 CGH ........................................................................ 40 3.3.2.3 MLPA ........................................................................... 44 3.3.2.3.1 Detección de alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales desequilibradas: ensayo de validación....................44 3.3.2.3.2 Detección de mosaicismos cromosómicos ........................... 46 3.3.2.4 1 Mb array CGH ................................................................ 47 3.4 Distribución temporal del trabajo ............................................. 52 4 RESULTADOS .................................................................... 53 4.1 QF-PCR .......................................................................... 54 4.1.1 Detección de alteraciones cromosómicas numéricas: ensayo de validación ................. 54 4.1.2 Detección de mosaicismos cromosómicos .............................. 62 4.1.2.1 Ensayo de sensibilidad en la detección de mosaicismos ......... 62 4.1.2.2 Resolución de un caso clínico ............................................. 63 4.1.2.3 Evidencia de mosaicismo cromosómico confinado a la placenta............................................... 64 4.1.3 Diagnóstico de molas hidatidiformes ...................................... 67 4.1.4 Determinación del origen parental y meiótico / mitótico de la aneuploidía ..................... 69 4.2 CGH ........................................................................... 70 4.3 MLPA ............................................................................. 72 4.3.1 Detección de alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales desequilibradas: ensayo de validación .................................................... 72 4.3.2 Detección de mosaicismos cromosómicos .............................. 78 4.4 1 Mb array CGH .................................................................. 79 5 DISCUSIÓN .............................................................. 82 5.1 Consideraciones acerca del procesado y selección de la muestra ............................................... 83 5.2 Valoración de las técnicas moleculares .............................. 85 5.2.1 QF-PCR ................................................................. 85 5.2.2 CGH ........................................................................... 88 5.2.3 MLPA ....................................................................... 89 5.2.4 1 Mb array CGH ............................................ 91 5.3 Protocolo óptimo recomendado para el estudio de alteraciones cromosómicas en abortos espontáneos .................... 93 5.4 Acerca de la conveniencia de reevaluar la incidencia de alteraciones cromosómicas en abortos espontáneos y parejas con abortos de repetición ................................................................................. 94 6 CONCLUSIONES ................................................................ 100 7 BIBLIOGRAFÍA .............................................................. 103 ANEXOS Anexo I -Comunicaciones a congresos tipo póster Anexo II-Publicaciones derivadas del presente trabajo Anexo III - Recursos en la web Anexo IV - Ideogramas del cariotipo humano Anexo V - Modelos de consentimiento informado