Identificación no invasiva de biomarcadores del sexo y de la viabilidad de la gestación en embriones bovinos producidos in vitro frescos y criopreservados.
- Autores: Isabel María Gimeno Miquel
- Directores de la Tesis: Enrique Gómez Piñeiro (dir. tes.), Marta Muñoz Llamosas (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Oviedo ( España ) en 2023
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Argüelles Luis (presid.), María Belén Rabaglino (voc.), Emilio Arsenio Martínez Garcia (voc.), Jose S. Vicente Antón (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Celular por la Universidad de Oviedo
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: RUO
- Resumen
El diagnóstico del sexo y la predicción de la capacidad del embrión para establecer la gestación y generar un ternero sano son objetivos de interés en vacuno. El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue identificar biomarcadores del sexo del embrión y de la viabilidad de la gestación de manera no invasiva mediante el análisis metabolómico del medio de cultivo del embrión, y estudiar la salud perinatal de los terneros nacidos de embriones frescos y criopreservados.
El objetivo del primer capítulo fue identificar biomarcadores del sexo del embrión. Para ello, se analizaron mediante UHPLC-MS/MS N=127 muestras de medio de cultivo de embriones sexados producidos in vitro y N=40 de embriones transferidos a receptoras cuyo sexo se asignó a partir del ternero. A continuación, se realizó un análisis por bloques con factores fijos que incluían el tipo de cultivo (con o sin suero), raza de cada toro usado para producir los embriones, y estadios de desarrollo del embrión en día 6 y día 7, puesto que estos factores influyeron en el metaboloma del medio de cultivo del embrión, obstaculizando la identificación de metabolitos biomarcadores. De esta manera se obtuvieron 182 bloques y 31 metabolitos que permiten identificar el sexo del embrión. Las clases de metabolitos más relevantes para la identificación del sexo fueron lípidos y aminoácidos. Se demostró que no existe ningún biomarcador universal para diagnosticar el sexo en todas las condiciones del estudio. Sin embargo, cada metabolito fue específico para unas condiciones concretas (es decir, raza, medio de cultivo y estadio o sus combinaciones), lo que permite diagnosticar el sexo de todos los embriones en un cultivo utilizando 2 ó 3 metabolitos, pero con un solo metabolito para cada embrión.
En el segundo capítulo se identificaron biomarcadores para predecir la gestación, para lo cual se analizaron por UHPLC-MS/MS N=84 muestras de embriones producidos in vitro que fueron transferidos frescos o congelados a receptoras sincronizadas. También se realizó un análisis por bloques con factores fijos que incluían el tipo de cultivo, raza de toro, estadios de desarrollo del embrión antes y después del cultivo individual, el estado del embrión transferido (fresco o congelado), y el diagnóstico de la gestación (es decir, si la receptora estaba preñada en día 40, día 62, y si la gestación llegó a término). Así, se obtuvieron 34 metabolitos implicados en 511 bloques, de los cuáles 198 bloques predijeron la gestación a término, 166 bloques la gestación en día 62, y 147 bloques en día 40. Determinados metabolitos mostraron una alta precisión en la predicción de la gestación en 95 bloques (ROC-AUC >0.7). En conjunto, según el análisis del metaboloma del medio de cultivo, los embriones que resultaron en gestación mostraron un consumo más elevado de aminoácidos y ácido cítrico, y menor de lípidos y ácido cis-aconítico que los embriones que no resultaron en gestación.
No obstante, el éxito de la gestación depende del embrión y de la receptora. Por ello, en el tercer capítulo usamos la información emparejada de 70 embriones y receptoras para desarrollar un modelo para predecir la gestación a término basado en aprendizaje e iteraciones. En primer lugar, identificamos biomarcadores de gestación mediante resonancia magnética nuclear (1H+RMN) en muestras de plasma de las receptoras obtenido en día 0 (estro) y día 7 (pocas horas antes de realizar la transferencia). Se realizó un estudio por bloques con factores fijos que incluían la raza de la receptora (Holstein o Asturiana de los Valles), el día de recogida de la sangre, y el estado del embrión transferido (fresco o congelado). Se identificaron 28 biomarcadores candidatos con representación en 190 bloques que predijeron la gestación. El metabolito más representativo entre bloques fue la creatina. Los metabolitos más eficaces para predecir la gestación a día 40, día 62 y a término a partir de plasma de día 0 fueron creatina, acetona y fenilalanina, mientras que glutamina, lisina y ornitina lo fueron con plasma de día 7. En general, se identificaron más biomarcadores en plasma de día 7 que en día 0, y su capacidad de predicción fue más alta en los días 40 y 62 de gestación que a término. Un mayor número de receptoras de embriones congelados fueron inicialmente mal clasificadas en comparación con las receptoras de embriones frescos, probablemente debido a las mayores pérdidas gestacionales. No obstante, la capacidad de estas receptoras para gestar se identificó correctamente cuando se contrastó con la información procedente del metaboloma analizado en el medio de cultivo del embrión. De esta manera, mediante aprendizaje e iteraciones, 12 biomarcadores mejoraron su ROC-AUC (>0.65) a término, y se identificaron 5 nuevos biomarcadores. Este enfoque mejoró sustancialmente la predicción de la gestación y la precisión de los biomarcadores.
Finalmente, en el cuarto capítulo se examinó la influencia de la criopreservación del embrión en la salud perinatal de terneros nacidos de embriones transferidos frescos (N=13), congelados (N=24) y vitrificados (N=14) en día 0 (antes y después de la ingesta de calostro), día 15 y día 30 de vida, con examen clínico (N=13 características) y análisis bioquímico hemático básico (N=18 analitos). Los terneros nacidos de embriones congelados, vitrificados y frescos no se distinguieron por su peso al nacimiento ni por la duración de la gestación. En día 0, antes de la ingesta del calostro, el tiempo de llenado capilar y la concentración de creatinina fueron más altos en los terneros nacidos de embriones vitrificados y congelados que en los frescos. La sangre de los terneros nacidos de embriones congelados mostró menor presión parcial de CO2 (PCO2) que los terneros procedentes de embriones frescos. Además, la ingesta de calostro no disminuyó la PCO2 en los terneros de embriones vitrificados, a diferencia de los congelados y frescos. El valor del hematocrito y la concentración de hemoglobina se redujeron en los terneros nacidos de embriones congelados con respecto a los nacidos de embriones vitrificados. En cambio, los terneros nacidos de embriones vitrificados mostraron niveles más altos de Na+ que los terneros procedentes de embriones frescos y congelados. En día 15, no se observaron efectos de la criopreservación del embrión en el ternero. Sin embargo, la aparición de diarrea, principalmente entre los días 15 y 30, redujo los valores de TCO2, HCO3- y BE en día 30, y aumentó los valores de anión gap, con un efecto más marcado en terneros nacidos de embriones vitrificados. Otros parámetros afectados por la diarrea fueron la temperatura, PCO2 y Na+, aunque sin diferencias entre grupos de terneros. No obstante, casi todos los valores obtenidos se encontraron comprendidos en rangos descritos como saludables en la literatura. Por tanto, se concluyó que la criopreservación de embriones afecta a los terneros sanos, con cambios más notables en día 0 que en los siguientes días de vida. Sin embargo, el calostro tuvo efectos comparables entre los tres grupos de terneros, indicando una capacidad adaptativa en los primeros días de vida similar entre todos ellos.
