Resumen de Canales iónicos ASIC en el cuerpo carotídeo
Introducción y estado actual del problema.- Los quimiorreceptores periféricos, especialmente el cuerpo carotídeo, son sensores capaces de detectar en sangre cambios en los niveles de oxígeno (hipoxemia), dióxido de carbono (hipercapnia), pH (acidosis) y glucosa (hipoglucemia).
Existen numerosos trabajos sobre la detección de la hipoxia y la hipercapnia por la células del cuerpo carotídeo; por el contrario, no son tan abundantes los relacionados con la acidosis. Estudios realizados durante la última década has puesto de manifiesto que algunas proteínas de membrana, entre ellas los canales iónicos sensibles a ácido (ASIC: acid-sensing ion channels), permiten que las neuronas sensoriales monitoreen la acidosis tisular. Los ASIC forman una familia de canales dependientes de protones sensibles al amiloride integrados en la superfamilia de los degenerina/canales de sodio epitelial (DEG/ENa+C). Los ASIC están presentes desde invertebrados hasta mamíferos, y tienen una expresión tisular muy amplia incluido el sistema nervioso. En la actualidad se han identificado seis isoformas ASIC (ASIC1a, 1b, 2a, 2b, 3 y 4) codificadas por cuatro genes (Accn1, Accn2, Accn3 y Accn4).
Los ASIC participan en la mecanosensación, la nocicepción y la quimiosensación. Los ASIC pueden activarse por una caída en el pH extracelular por debajo de 7.0 así como por ligandos de protones en niveles de pH fisiológicos.
En cuanto al cuerpo carotídeo, se ha propuesto que la acidosis extracelular y una caída en el pH intracelular activan los quimiorreceptores a través de canales ASIC. En este sentido, se han observado corrientes dependientes de protones con propiedades biofísicas y farmacológicas comparables con las de los ASIC, y expresión de ASIC1 y ASIC3, en diferentes grupos de células tipo I que median la respuesta al pH y la hipoxia. Sin embargo, el papel de los ASIC en el cuerpo carotídeo no es homogéneo ya que la delección de Asic3 interrumpe el aumento de Ca2+ intracelular evocado en respuesta a la acidificación extracelular pero no a la hipoxia y la pérdida de ASIC1, ASIC2 o ASIC3 no altera significativamente las respuestas ventilatorias hipercápnicas o hipóxicas.
Hasta donde conocemos, no hay datos disponibles sobre la distribución de los canales ASIC en el cuerpo carotídeo humano. Por lo tanto, el presente trabajo de tesis doctoral se diseñó para analizar mediante técnicas inmunohistoquímicas la presencia de canales iónicos de la familia ASIC en el cuerpo carotídeo humano, y para determinar si se expresan en fibras nerviosas o en las células glómicas. Este estudio tiene como objetivo principal servir como base en futuros estudios en patologías en las que está involucrado el cuerpo carotídeo.
Hipótesis y objetivos.- Hipótesis: Los canales iónicos sensibles a ácido intervienen en la detección de la acidosis por parte del cuerpo carotídeo y, por tanto, deben de expresarse en las células quimiosensoras y/o en los aferentes nerviosos del mismo. Objetivos: El objetivo general es contribuir a conocimiento de los mecanismos por los que el cuerpo carotídeo humano detecta las variaciones en la acidosis intra y extracelular. Los objetivos específicos son los siguientes: 1.- Estudiar la distribución de las principales isoformas de los canales iónicos de la familia ASIC en el cuerpo carotídeo humano; y 2.- Estudiar la distribución de las principales isoformas de los canales iónicos de la familia ASIC en el ganglio petroso y en el ganglio simpático cervical superior humanos, localización de los somas aferentes y eferentes, respectivamente, del aparato nervioso del cuerpo carotídeo humano.
Material y técnicas.- Se utilizaron piezas de 8 donantes multiorgánicos (5 hombres y 3 mujeres), con edades comprendidas entre los 38 y 68 años, fallecidos en accidentes de tráfico (Hospital Universitario Central de Asturias) que contenían la bifurcación de la arteria carótida común y el cuerpo carotídeo procedentes. Además, se incluyeron en el estudio el ganglio petroso (n = 6) y el ganglio simpático cervical superior (n = 4) de los mismos sujetos. El material se obtuvo de conformidad con la Legislación española (RD 1301/2006; Ley 14/2007; RD 1716/2011; Orden ECC/1404/2013) y las directrices de la Declaración de Helsinki II. Las muestras se fijaron en formaldehído al 10 % en PBS 0,1 M, pH 7,4 durante 24 h a 4° C, se deshidrataron y se incluyeron de forma rutinaria en parafina. En el momento del uso, los bloques de parafina se cortaron en secciones seriadas de 10µm de espesor y se montaron sobre portas gelatinizados.
Inmunohistoquímica simple: método PAP: Para detectar la expresión de proteínas ASIC en el cuerpo carotídeo se utilizó el método de inmunohistoquímica indirecta peroxidasa-antiperoxidasa. Las secciones se incubaron durante toda la noche en una cámara húmeda a 4° C con anticuerpos primarios que se recogen en la tabla.
Antígeno Origen Dilución Suministrador ASIC1 Conejo 1:200 Abcam 1 ASIC2 Conejo 1:200 LifeSpan 2 ASIC3 Conejo 1:100 Abcam 1 ASIC4 Conejo 1:100 LifeSpan 2 NSE (clone BBS/NC/VI-H14) Ratón 1:500 Dako 3 NFP (clone 2F11) Ratón 1:200 Roche 4 Sinaptofisina (clone 27G12) Ratón Prediluido Leica Biosystems 5 S100 P Ratón 1:500 Dako 3 1Cambridge, UK; 2 Seattle, WA, USA; 3Glostrup, Denmark; 4Viena, Austria; 5Madrid, Spain.
Inmunofluorescencia con microscopía confocal: Las secciones también se procesaron para la detección simultánea de los diferentes ASICs con proteínas específicas para el marcaje de lo axones (NSE, NFP), células Schwann-like (proteína S100; S100P) y vesículas de neurotransmisores (sinaptofisina; Syn). Las secciones se incubaron con una mezcla 1:1 v/v de anticuerpo policlonal contra ASIC y anticuerpos monoclonales contra NSE, NFP y Syn en una cámara húmeda durante la noche a 4 °C. Después de lavar con TBS, las secciones se incubaron durante una hora con IgG anti-conejo bovino conjugado con CFL488 (diluido 1:200) y luego, enjuagado e incubado nuevamente durante otra hora con anticuerpo anti-ratón de burro conjugado con CyTM3 (diluido 1:100). Ambos pasos se realizaron en cámara húmeda oscura a temperatura ambiente. Las secciones finalmente se lavaron y los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (10 ng/mL). La triple fluorescencia se detectó utilizando un microscopio de fluorescencia automático Leica DMR-XA (Microscopía fotónica y Proceso de imagen, Servicios científico-técnicos, Universidad de Oviedo) junto con un software Leica Confocal (versión 2.5; Leica Microsystems, Heidelberg GmbH, Alemania), y las imágenes capturadas se procesaron con el software Image J (versión 1.43 g; Master Biophotonics Facility, Mac Master University Ontario; www.macbiophotonics.ca, acceso el 11 de enero de 2021).
Resultados y Discusión.- La estructura del cuerpo carotídeo humano es el glomérulos y lóbulos glómicos; las células quimiorreceptoras se disponen en clusters de distintos tamaños y fueron positivas para la NSE y la SYN, mientras que las células de tipo II, se disponían en la parte periférica de los glomérulos y fueron positivas para S100P. La inmunorreacción para NFP, utilizada para evidenciar la inervación del cuero carotídeo, puso en evidencia que esta proteína sólo marca parcialmente el aparato nervioso del órgano. No obstante, se evidenció una red nerviosa en la periferia de los glomérulos, ocasionalmente en el interior de estos en contacto con las células quimiorreceptoras, y formando plexos perivasculares. Se asume que la primera es la inervación aferente y la segunda la eferentes.
Respeto a la inmunorreacción para las diferentes isoformas ASIC, tanto con la microscopía de luz como mediante inmunofluorescencia se detecto positividad para ASIC1, ASIC2 y ASIC3, y en mucha menor medida para ASIC4. En todos los casos, las diferentes isoformas se localizaron tanto en las células quimiorreceptoras como en los terminales nerviosos, con amplias variaciones entre glomérulos y para cada una de las isoformas de ASIC. Por otro lado, se detectaron poblaciones neuronales variables con inmunorreacción para cada isoforma ASIC en el ganglio petroso y en el ganglio simpático cervical superior.
Los resultados sugieren que en el cuerpo carotídeo humano las proteínas de membrana ASIC, en condiciones de normalidad, intervienen de manera variable en la detección de las variaciones del pH intra y extracelular. En cualquier caso, la presencia inconstante en las células quimiorreceptoras de canales iónicos ASIC y de forma constate en las neuronas aferentes y eferentes que suplen el cuerpo carotídeo sugieren que las proteínas de las neuronas, y no las células del cuerpo carotídeo, son las claves en la detección de la acidosis por medio de los canales iónicos ASIC.
