Resumen de Generación de una plataforma de análisis funcional de variantes en PMM2 con fines diagnósticos y terapéuticos
La deficiencia de fosfomanomutasa 2 o PMM2-CDG, el defecto congénito de glicosilación (CDG) más frecuente, es una patología severa multisistémica considerada una enfermedad conformacional para la que no existe tratamiento. La identificación de la farmacochaperona (PC) 1-(3-clorofenil)-3,3-bis(piridin-2-il)urea (CVIII) abre el camino a una potencial terapia farmacológica para esta enfermedad huérfana. Con este fin, este trabajo se ha centrado en avanzar en el desarrollo de una terapia con PCs mediante la generación de una plataforma de evaluación de variantes clínicas y de moléculas pequeñas.
Las variantes clínicas seleccionadas, identificadas en pacientes con PMM2-CDG, fueron analizadas en la estructura de PMM2, en un modelo de expresión procariota y en un modelo de expresión eucariota generado por CRISPR-Cas9.
En el sistema procariota se expresaron 13 variantes de las cuales 5 no habían sido descritas anteriormente, entre ellas p.Glu146Lys y p.Asn216Asp, que fueron identificadas en un proceso de asesoramiento reproductivo. Todas las variantes, excepto p.Asp65Gly y p.Thr237Lys, se expresaron en el sistema procariota mostrando todas ellas una actividad enzimática reducida entre el 10-65 % comparada con la proteína wild-type, a excepción de p.Thr18Ser que reveló una actividad del 99 %. Los resultados obtenidos del estudio de las proteínas mutantes (oligomerización, actividad y estabilidad), junto con la predicción del efecto a partir de su análisis estructural, han permitido identificar variantes hipomórficas.
En el modelo eucariota basado en la expresión constitutiva de los mutantes en la línea knockout de PMM2 en HepG2 se estudiaron las variantes p.Thr18Ser, p.Asp65Gly y p.Thr237Lys. Los resultados obtenidos en este sistema confirmaron el efecto severo sobre la estabilidad observado para p.Asp65Gly y p.Thr237Lys, así como la elevada actividad del mutante p.Thr18Ser, evidenciando su suavidad. Esta plataforma se ha utilizado para evaluar el efecto del CVIII y sus derivados obtenidos por química médica. La evaluación del efecto del CVIII sobre la estabilidad de las proteínas recombinantes reveló la recuperación de la estabilidad térmica de los 9 mutantes ensayados, confirmando su efecto estabilizante y la posibilidad de recuperar la actividad de la proteína PMM2 portadora de estas variantes ampliando el espectro de pacientes que se beneficiarían de una terapia con PCs.
La evaluación en el modelo celular eucariota ha supuesto la generación de un sistema de análisis de farmacochaperonas para analizar la mejora de la estabilidad de PMM2 y, en consecuencia, de su actividad. Los resultados preliminares revelan la existencia de un grupo de compuestos que superaría el potencial farmacológico del CVIII, abriendo una ventana de oportunidad a la mejora de la eficacia de esta PC
