Aproximaciones ómicas para el manejo de la verticilosis del olivo: microbioma de la raíz y patrones de expresión génica del huésped y del patógeno en relación con la susceptibilidad a la enfermedad
- Autores: Martina Cardoni
- Directores de la Tesis: Jesús Mercado Blanco (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2023
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Gabriele Berg (presid.), Maria del Carmen Ruíz Roldán (secret.), Sotirios Tzamos (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ingeniería Agraria, Alimentaria, Forestal y del Desarrollo Rural Sostenible por la Universidad de Córdoba y la Universidad de Sevilla
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. Introducción o motivación de la tesis: El olivo (Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea) es uno de los cultivos arbóreos más importantes en las zonas templadas de todo el mundo. Constituye un agro ecosistema de gran relevancia para el sur de Europa, donde se concentra el 63,7% de la producción mundial. Sin embargo, muchos factores a/bióticos como las condiciones climáticas, la sequía y la presencia de patógenos y plagas de difícil erradicación, suponen una amenaza para este cultivo. Actualmente, la verticilosis del olivo (VO), causada por el hongo hemibiotrófico del suelo Verticillium dahliae Kleb. (división Ascomycota, familia Plectosphaerellaceae) es considerada uno de los principales factores limitantes para el cultivo del olivo en zonas de clima tipo mediterráneo, provocando una alta mortalidad de árboles y reducción de la productividad y rendimiento de frutos. Además, esta enfermedad es muy difícil de controlar debido a la propia naturaleza del patógeno y la amplia gama de factores epidemiológicos que favorecen su creciente incidencia y la gravedad de sus ataques. Hasta la fecha, las medidas de control individuales empleadas contra la VO han sido ineficaces. En consecuencia, se recomienda la implementación de una estrategia de manejo integrado de la enfermedad, considerando todos los métodos disponibles antes y después de la plantación, para manejar la enfermedad y mitigar la dispersión del patógeno que la provoca. Dentro de esta estrategia, el uso de cultivares de olivo tolerantes/resistentes es una herramienta de control prometedora, respetuosa del medio ambiente y económicamente rentable. Aunque hasta ahora ningún cultivar de olivo ha sido clasificado como completamente resistente a VO, algunas variedades han mostrado un nivel de tolerancia moderado/alto (Trapero et al., 2012;2015). Estas son capaces de restringir la colonización de los tejidos vegetales por parte del patógeno, retrasando o dificultando el progreso de la enfermedad, aumentando la recuperación de las plantas infectadas y reduciendo el porcentaje de plantas muertas en comparación con los cultivares susceptibles (Tsror, 2011). La tolerancia de la planta está determinada por una combinación de mecanismos de defensa constitutivos (antes de la infección) e inducibles (durante el ataque de patógenos) (Thatcher et al., 2005). Los primeros involucran barreras o reservorios estratégicamente ubicados de compuestos antimicrobianos capaces de prevenir la colonización de tejidos. En cambio, los mecanismos inducidos se basan en un sistema multicapa de señales bioquímicos y moleculares destinados a la activación de respuestas locales y sistémicas y de la resistencia de amplio espectro. Notablemente, la comunidad microbiana asociada a las plantas también puede desempeñar un papel clave en ambos tipos de mecanismos de defensa. En el caso particular de la VO, varios estudios han demostrado que los primeros mecanismos de defensa contra V. dahliae tienen lugar en las raíces (Bubicci and Cirulli, 2012). Para las plantas de olivo, se dispone de información limitada sobre los mecanismos de defensa subterráneos y la tolerancia a V. dahliae. Además, si bien se han realizado investigaciones sobre componentes beneficiosos específicos de la microbiota asociada al olivo, principalmente con el objetivo de aislar y caracterizar agentes de control biológico (ACB) contra diferentes patógenos, incluido V. dahliae, solo pocos estudios se han centrado en las comunidades microbianas autóctonas del olivo.
2.Contenido de la investigación: Esta tesis tuvo como objetivo dilucidar diferentes mecanismos de defensa a nivel subterráneos que contribuyen a la tolerancia o susceptibilidad a la VO de cultivares de olivo seleccionados en cuatro niveles diferentes: 1) estructural, mediante el análisis de las características funcionales de la hoja, del tallo y especialmente de la raíz (Olmo et al., 2014; 2019) bioquímica, mediante la cuantificación del contenido basal de lignina y metabolitos secundarios de la raíz, y mediante la evaluación de sus posibles cambios por la presencia de V. dahliae (Gharbi et al., 2017a); 3) genética, mediante la evaluación de la expresión en el tiempo de genes seleccionados que codifican proteínas involucradas en la ruta de biosíntesis de lignina (C4H y CO-MT), respuesta a ROS (APX y POX), respuesta de defensa mediada por proteínas (es decir, quitinasa, ß -1,3-glucanasa), así como la proteína de respuesta a la resistencia a enfermedades (DRR2), el gen asociado al receptor 1 de la quinasa insensible a los brasinoesteroides (BAK1) y el factor de transducción de señales del ácido salicílico (SA) (WRKY5) (Gharbi et al., 2017b; Gómez-Lama Cabanás et al., 2015) y 4) fisiológico, mediante la evaluación de alteraciones en la permeabilidad de la membrana celular de la raíz en presencia del patógeno. Asimismo, se llevó a cabo la caracterización de las comunidades microbianas asociadas a cultivares sensibles o tolerantes a la VO y la evaluación de posibles alteraciones provocadas por la inoculación con V. dahliae. Finalmente, fue evaluado también el impacto que tuvo la introducción de dos rizobacterias conocidas por su actividad de biocontrol contra la VO (Pseudomonas simiae PICF7 y Paenibacillus polymyxa PIC73) (Gómez-Lama Cabanás 2018a; b) sobre la microbiota de la raíz de un cultivar sensible a V. dahliae, tanto en presencia como en ausencia del patógeno Los rasgos funcionales de la hoja y del tallo jugaron un papel menor en la tolerancia de los cultivares de olivo a la VO. Por otra parte, las características fisiológicas de las hojas no mostraron diferencias significativas antes de la inoculación de V. dahliae, pero presentaron cambios importantes (p. ej., disminución de la fotosíntesis, transpiración y conductancia estomática en los cultivares susceptibles a la VO) después de la infección con el patógenos. Esto indicó la adopción de estrategias diferentes por parte de cultivares tolerantes y susceptibles a la VO para hacer frente a V. dahliae, lo que puede estar relacionado principalmente con la obstrucción del flujo de agua causada por el patógeno. Por el contrario, se estableció una fuerte relación entre la arquitectura de la raíz y la tolerancia/susceptibilidad de los cultivares de olivo a V. dahliae. De hecho, en los cultivares tolerantes a la VO prevalecía un sistema radicular con menor superficie y longitud y bajo número de cofias y ramificaciones, lo que los hace menos expuestos a los propágulos de patógenos. La composición de la raíz fue otro factor que influyó fuertemente en la tolerancia al patógeno. Las plantas tolerantes a la VO presentaron un mayor contenido basal de lignina y secoridoides. Estos son metabolitos secundarios con actividad antifúngica o que pueden oxidarse fácilmente para crear un ambiente desfavorable para el patógeno. Además, la rapidez para sintetizar estos compuestos durante la infección por parte de patógenos, así como para engrosar la pared celular creando una barrera física (lignina y sus monómeros), y para afectar directamente al patógeno (fenoles) fue un factor clave para contrarrestar el proceso de colonización de las raíces por V dalhiae. El análisis de la expresión génica a lo largo del tiempo confirmó la importancia de una pronta "detección" del patógeno por parte de la planta y la subsiguiente rápida activación de una respuesta de defensa eficiente en las variedades tolerantes a la VO. De hecho, la activación temprana de genes relacionados con la vía de biosíntesis de la lignina (C4H), las enzimas de degradación de la pared celular fúngica (que codifican quitinasa y ß-1,3-glucanasa), la proteína de respuesta a la resistencia a enfermedades (DRR2) y la activación de la inmunidad innata (BAK1) fue fundamental para enfrentar con éxito la enfermedad en estos cultivares. Además, estos resultados confirmaron los resultados relativos a la deposición diferencial de lignina y su composición de monómeros. El rápido aumento de la permeabilidad de la membrana celular de la raíz en los cultivares tolerantes confirmó una reacción más rápida a la presencia del patógeno en estas plantas en comparación con la que se observó en las susceptibles, como indicaron también las respuestas a nivel bioquímico y genético. De hecho, el aumento de la permeabilidad de la membrana es la reacción más temprana de la célula vegetal a los inductores fúngicos, y sus alteraciones, debidas al intercambio de iones y protones, son concomitantes con la inducción de genes de respuesta de defensa y la producción de metabolitos relacionados con la defensa. Esta tesis también destacó vínculos importantes entre la composición de la microbiota subterránea y la tolerancia/susceptibilidad a V. dahliae. De hecho, la mayor abundancia relativa de géneros frecuentemente descritos como microorganismos promotores del crecimiento de la planta (MPCP) (e.g., Neorhizobium, Nocardia, Acremonium, Bradyrhizobium) se relacionó con una mayor tolerancia a V. dahliae, mientras que la presencia de géneros fúngicos que incluyen especies fitopatógenas (e.g., Fusarium, Macrophomina, Rhizoctonia) se vinculó con una mayor susceptibilidad a la VO. Es interesante señalar que no se detectaron cambios a nivel estructural y funcional en las comunidades microbianas subterráneas después de la inoculación con V. dahliae. Por el contrario, se produjeron alteraciones significativas en las topologías de las redes, con importantes diferencias entre las comunidades microbianas de la endosfera de la raíz y la rizosfera. En el primer compartimento, las plantas tolerantes y susceptibles mostraron modificaciones opuestas en sus redes, mientras que se observaron cambios similares en las interacciones de co-ocurrencia de las comunidades presentes en la rizosfera de las plantas tolerantes y susceptibles a la VO. Sin embargo, el patógeno se detectó solo en la red de los cultivares susceptibles. De hecho, el patógeno pudo interactuar fuertemente con el módulo más grande de la red microbiana de la rizosfera sensible a la VO, tanto a nivel estructural como funcional, un resultado nunca observado en las plantas tolerantes. Fue evaluado también el impacto de la aplicación de dos diferentes rizobacterias beneficiosas efectivas contra las VO sobre la microbiota autóctona de la raíz de un cultivar susceptible. Estos efectos se estudiaron en presencia y ausencia de V. dahliae. No se observaron cambios en la estructura y composición de la comunidad microbiana subterránea ni después de la inoculación con V. dahliae, lo que confirma los resultados anteriores obtenidos en esta tesis, ni después de la bacterización con cualquiera de los dos ACBs. La presencia de las bacterias de biocontrol solo provocó cambios significativos en la abundancia relativa de algunos taxones principales con capacidad PCP y/o antagonistas de V. dahliae, lo que sugiere que uno de los mecanismos de biocontrol ejercido por estos ACBs puede consistir en modificaciones sutiles del perfil taxonómico de las microbiota autóctona de raíz de olivo. Sin embargo, el efecto más importante después del tratamiento con ACB y/o la inoculación de V. dahliae consistió en alteraciones de las topologías de las redes microbianas. Los cambios en la microbiota subterránea del olivo provocados por la introducción de cada uno de los agentes de biocontrol examinados difieren notablemente, lo que sugiere la adopción de diferentes estrategias de biocontrol. Por lo tanto, la inoculación con P. polymyxa PIC73 aumentó el número de interacciones competitivas entre los miembros de la microbiota de la raíz del olivo, lo que probablemente mejoró la capacidad de la comunidad residente para hacer frente mejor a la invasión de V. dahliae. Por el contrario, la presencia de P. simiae PICF7 redujo las interacciones entre los módulos de la red, aumentando la estabilidad de la comunidad y limitando las perturbaciones y el daño potencial causado por la presencia del patógeno a "puntos" específicos de la comunidad.
3.Conclusión: Esta tesis dilucida la relación entre la tolerancia/susceptibilidad a V. dahliae y el sistema radicular del olivo en su conjunto; es decir, considerando puntos de vista morfológicos, bioquímicos, genéticos y microbiológicos. La tolerancia de una determinada variedad de olivo depende de la suma de características constitutivas estructurales, fisiológicas y bioquímicas que bloquean, o al menos ralentizan, el proceso de invasión de patógenos. Además, la eficiencia y rapidez del olivo para activar ulteriores mecanismos de defensa específicos (p. ej., expresión génica, depósito de lignina, cambios cuantitativos en el contenido de metabolitos secundarios, ajuste de la permeabilidad de la membrana celular) ante el ataque de V. dahliae también es decisiva. Finalmente, la composición del microbioma de la raíz de olivo y, principalmente, los cambios en las interacciones de co-ocurrencia que se producen entre sus integrantes para responder a perturbaciones externas (i.e. inoculación de patógenos y/o ACB), también influyen de manera decisiva en la respuesta de un determinado cultivar de olivo frente a V. dahliae. Estos hallazgos contribuirán a generar alternativas innovadoras y más holísticas para el manejo efectivo de la VO.
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