Resumen de Síntesis y caracterización de sonogeles de sílice - quitosano - trifosfato cálcico y pruebas biológicas para valorar su uso en la regeneración ósea
La presente tesis doctoral tiene como objetivo la obtención de biomateriales porosos bioactivos mediante la tecnología sol-gel, para utilizarlos en la reparación y regeneración de defectos óseos mediante ingeniería de tejidos. El trabajo tiene su origen en el creciente interés existente para desarrollar terapias regenerativas avanzadas que ofrezcan nuevas opciones de tratamiento de lesiones óseas. Las terapias actuales para reparar estas lesiones consisten habitualmente en el uso de prótesis y en la aplicación de injertos, pero a menudo presentan dificultades que limitan su efectividad (falta de osteointegración, reacciones inmunes, infecciones, etc.). La ingeniería tisular ósea nace para ofrecer soluciones a estos problemas y propone el desarrollo de metodologías alternativas que produzcan implantes biocompatibles para favorecer la formación de nuevo tejido y así recuperar la funcionalidad de la zona dañada.
En particular, la incorporación de biopolímeros biológicamente activos tales como el quitosano en la composición de dichos implantes, promueven los mecanismos bioquímicos y fisiológicos del proceso de regeneración ósea. En este sentido, el método sol-gel es un procedimiento que permite el diseño y producción de nuevos biomateriales híbridos que combinan fases orgánicas e inorgánicas, que desempeñan un papel importante en los procesos naturales de reparación y regeneración ósea, ya que facilitan el desarrollo de superficies bioactivas, lo que en parte representa el propósito general de la presente investigación. Así, la hipótesis de este trabajo es que la combinación de un polímero natural con geles de sílice mesoporosa permite lograr un nuevo biomaterial híbrido bioactivo que sirva como implante para acelerar el proceso de regeneración del tejido óseo. Por último, se examina la influencia que el trifosfato de calcio (TCP), como componente principal del hueso natural, ejerce sobre la capacidad regenerativa de alguno de los materiales obtenidos.
Para el desarrollo y consecución de las finalidades y objetivos planteados se prepararon vía sol-gel geles híbridos mesoporosos en el sistema SiO2/quitosano con distintas propiedades texturales, de acuerdo a la siguiente planificación metodológica:
1. Obtención de xerogeles y aerogeles híbridos biocompatibles con aplicaciones en regeneración ósea.
2. Determinación de las composiciones químicas de los biomateriales obtenidos con las mejores respuestas bioactivas para optimizar la capacidad regenerativa del tejido óseo.
3. Optimización de las condiciones y parámetros de síntesis para reducir los tiempos de procesado.
4. Optimización de las distintas composiciones para obtener la mejor respuesta celular con el fin de conseguir osteoconducción y osteoinducción.
Los geles han sido preparados por el método sol-gel utilizando tetraetoxisilano (TEOS) y quitosano en polvo (CS, grado desacetilación 75%). La hibridación entre las redes inorgánicas y orgánicas de ambos precursores tiene lugar a través de reacciones de hidrólisis y policondensación en medio ácido, aplicando ultrasonidos de alta potencia. De esta manera se obtiene una serie de geles húmedos de composición variable, designados como SCSx, (x = 4, 8, 12, 16 y 20 % de quitosano en peso) los cuales han sido transformados en sus correspondientes xerogeles por evaporación directa del solvente (entre 50 ºC y 80 ºC), presentando diferentes propiedades texturales. Previamente al secado de los geles húmedos se ha examinado la influencia que la etapa de lavado ejerce sobre la microestructura, la bioactividad, y su biodegradación en solución salina. Como consecuencia, se ha demostrado que la utilización de etanol absoluto durante una semana en dicha etapa resulta ventajosa para optimizar la superficie específica de los xerogeles, frente a otras combinaciones de solventes y tiempos, observándose densidades aparentes entre 0.36 y 0.63 g/cm3, superficies específicas de aproximadamente 800 m2g-1 y la existencia de una porosidad interconectada. Por otra parte, los xerogeles así obtenidos han experimentado biodegradación y liberación de iones Ca (2-12 mgL-1) y Si (67-75 mgL-1) al medio. Asimismo, para evaluar el efecto de la composición sobre la respuesta bioactiva de los distintos materiales, se han realizado ensayos de bioactividad in vitro, exponiendo a todos los geles al contacto con SBF (Simulated Body Fluid), fluido artificial que simula las condiciones corporales. Los resultados demostraron una elevada bioactividad en forma de crecimiento de una capa cristalina de hidroxiapatita (HAp) que recubre a la superficie de los materiales, fundamentalmente en el caso de xerogeles SCS8, sometidos previamente a lavado en etanol durante una semana e inmersos en SBF durante otras cuatro. Por ello, este material ha sido elegido para evaluar la influencia que sobre la bioactividad y propiedades regenerativas ejerce la incorporación de TCP en la composición química del xerogel, y con esa finalidad se añadieron distintas cantidades del producto durante la síntesis de los correspondiente xerogeles, siendo designados como SCS8Ty (y = 10, 20 % de TCP en peso). Se confirmó que los xerogeles con 10% de TCP en peso generaron una fuerte respuesta bioactiva, favoreciendo la aparición de una capa formada por esferulitas de HAp, desde tamaño submicrométrico hasta un máximo de 10 m, tras inmersión en SBF por un periodo de 4 semanas.
A continuación se ha abordado un estudio in vitro sobre osteoblastos humanos (línea HOB®) como requisito inicial para que los geles diseñados se propongan para uso clínico.
Tras dicho estudio, se ha comprobado que la adhesión, la unión, el crecimiento celular y los cambios morfológicos de los osteoblastos parecieron ser sustancialmente mejores en las muestras de xerogeles de sílice-quitosano que en las células cultivadas en el sustrato desnudo, revelándose en las primeras una unión celular exitosa con cambios morfológicos marcados, como emisión filopodial y lamelipodial, y una mejor propagación celular. Por otra parte, las células cultivadas en presencia de xerogeles desarrollan complejos de adhesión celular más eficientes como pasos iniciales para la diferenciación, mostrando un aumento dependiente del tiempo y la composición en el número y tamaño de las adhesiones focales (FAs).
El efecto del TCP se aprecia especialmente en las FAs desarrolladas por las células. Las cultivadas en xerogeles sin fosfato cálcico desarrollaron un mayor porcentaje de FAs puntiformes, no maduras, es decir, <0.2 µm2 que las células cultivadas en xerogeles con TCP. Por el contrario, el porcentaje de FAs maduras de tamaño >1.0 µm2 fue significativamente mayor en los cultivos con TCP.
Conocida la influencia que tanto la composición química como la etapa de lavado del gel húmedo tienen sobre la textura y capacidad regenerativa de los xerogeles del sistema SiO2/quitosano (4-20 wt %), nos interesamos a continuación sobre el efecto que el procedimiento de secado de los geles húmedos tendrá en la estructura y propiedades de los materiales. Con este fin se ha preparado un conjunto de aerogeles del mismo sistema y composiciones. Para ello, los geles húmedos han sido sometidos al secado en condiciones supercríticas de CO2 (31ºC, 72 bar), que evita la degradación del quitosano y permite conservar más fielmente la microestructura de los geles húmedos. El procedimiento se realiza en autoclave, repitiendo las composiciones que fueron previamente obtenidas en xerogeles, excepto en los casos de muestras que contenían TCP, ya que éste resulta eliminado durante el proceso de extracción del solvente. Los aerogeles obtenidos resultan ser monolíticos, libres de fracturas, con densidades entre 0.13-0.19 g/cm3, elevadas superficies específicas (800-1100 m2g-1), así como un gran volumen poroso (2.5-4.0 cm3g-1).
El análisis termogravimétrico (TGA) junto con la caracterización de grupos funcionales presentes en la sílice y en el biopolímero efectuada por FTIR (espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier) ha proporcionado información relevante, no sólo sobre la reticulación de la red de sílice por las cadenas de quitosano (1100-1200 cm-1), sino también sobre la gran cantidad de hidroxilos superficiales existentes. Según esto, resulta que el contenido en quitosano controla la densidad de grupos hidroxilo en superficie (OH nm-2), los cuales actúan como sitios preferentes de nucleación para el crecimiento de cristales de HAp. Tras sólo dos semanas de inmersión de aerogeles de composición SCS8 en SBF se ha observado un tamaño de cristal de 6 µm y una relación molar Ca/P estequiométrica de 1.67. El resultado es aplicable a casi todos los aerogeles obtenidos, los cuales además presentan una respuesta mecánica elástica en compresión uniaxial, con modulo de Young entre 2.61 0.56-0.72 0.16 MPa, que disminuye al aumentar el contenido en CS, siendo la composición SCS8 la que presenta la mejor relación entre propiedades mecánicas y densidad de grupos -OH en superficie.
Los cultivos celulares en presencia del aerogel mostraron que los osteoblastos comenzaron a polarizarse después de 24 h en cultivo, y pasadas 48 h, se acercaron al material uniéndose a él con emisiones filopodiales y lamelipodiales. Una vez alcanzado el material, este se recubre por la migración de osteoblastos a partir de las 48 h. La viabilidad celular en la siembra fue de hasta el 98%. No se detecta ningún fenómeno apoptótico significativo ni en el grupo de control ni en el experimental. En relación con las adhesiones focales, las células que crecen en el material desarrollan complejos de adhesión celular más eficientes que las de los grupos de control positivo, presentando un mayor número de adhesiones focales maduras. Por otra parte, los osteoblastos cultivados en SCS8 presentaron polarización celular, alargamiento y expresión significativa de fibras de estrés, lo cual ha sido descrito como un marcador de la adhesión y diferenciación celular, debido a su papel en el reordenamiento citoesquelético. En definitiva, los resultados obtenidos mostraron un efecto positivo del aerogel SCS8 tanto en las funciones osteoconductoras como osteoinductoras.
Si comparamos el comportamiento biológico de aerogeles y xerogeles, llegamos a la conclusión de que ambos ofrecen un conjunto adecuado de características, como biocompatibilidad, biodegradabilidad, carácter hidrofílico y ausencia de toxicidad. Además, son materiales químicamente atractivos y brindan pistas adicionales para el posicionamiento, la propagación y la diferenciación celular. En concreto, la mejor respuesta osteoblástica se observó en presencia del xerogel SCS8T10, con indicadores que favorecen la secreción adecuada de osteoide. Las muestras sin TCP requirieron más tiempo para inducir una respuesta de diferenciación osteoblástica comparable a la de las muestras enriquecidas con TCP, y los osteoblastos que crecieron en estas muestras mantuvieron una buena capacidad de migración durante bastante tiempo. Todas las muestras de xerogel parecían inducir la diferenciación celular antes que los aerogeles con composiciones idénticas. Finalmente, los datos obtenidos para las muestras compuestas únicamente por SiO2 mostraron la menor influencia sobre los indicadores de diferenciación utilizados en los periodos de tiempo estudiados, y la respuesta celular fue mucho más lenta.
En conclusión, el trabajo demuestra que los biomateriales diseñados durante esta Tesis Doctoral presentan características fisicoquímicas y topográficas que potencialmente favorecerían una adecuada respuesta celular y pueden ser útiles en el diseño futuro de sistemas de regeneración ósea.
