Evaluación de la actividad frente a bacterias del grupo ESKAPE-E de extractos etanólicos y compuestos de plantas nativas de la región Caribe colombiana

• Autores: Yina Pájaro González
• Directores de la Tesis: Fredyc Díaz Castillo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Cartagena (Colombia) ( Colombia ) en 2023
• Idioma: español
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  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen

  • Colombia es uno de los países con mayor diversidad de plantas en todo el planeta; el número de especies registradas en el catálogo de plantas y líquenes en todo el territorio nacional es de más de 29.000 especies. El catálogo ofrece un listado de especies para cada región geográfica y departamentos del país, lo que permite la selección de ellas para diferentes estudios científicos y otros propósitos. La región Caribe colombiana se caracteriza por poseer áreas de bosque seco tropical con disponibilidad de especies que, según lo reportado en la literatura, han sido poco o nada incluidas en estudios para investigar su actividad farmacológica. La posibilidad de encontrar moléculas nuevas con características de fármacos para posibles usos terapéuticos siempre estará presente, mientras que no se haya explorado la totalidad de las plantas en el mundo; después de todo, la bioquímica particular de las plantas ha sido por milenios la fuente natural de componentes para la farmacoterapia.

    La terapia antibacteriana ha estado soportada en moléculas de origen natural, principalmente, metabolitos secundarios de bacterias del género Streptomyces y hongos. Sin embargo, se ha demostrado que los antibióticos obtenidos de una especie bacteriana, por lo general, poseen un mecanismo de resistencia natural codificado por genes dentro del genoma de otro microorganismo, a partir del cual, es transferido y propagado a otras especies por diferentes mecanismos; una vez adquirido un gen resistente se produce el fenómeno de selección y en consecuencia un aumento en la incidencia de cepas resistentes, lo que es más notorio en las infecciones causadas por bacterias patógenas. Este es uno de los principales motivos por el cual la farmacoterapia con antibacterianos ha fracasado ante la resistencia de las bacterias.

    Hace varios años que se intenta encontrar antibacterianos mediante la síntesis química de moléculas, pero se ha tenido poco éxito a pesar de la gran cantidad de moléculas ensayadas en grandes laboratorios farmacéuticos como Glaxo Smith Kline y otros. Esto ha facilitado el auge de fuentes poco exploradas como las plantas, y en el presente ya hay resultados alentadores. Se han encontrado metabolitos secundarios vegetales con valores de concentración mínima inhibitoria del crecimiento bacteriano comparables a las de antibióticos de uso clínico, su principal desventaja es que no son de amplio espectro. A pesar de esto, es necesario continuar con la búsqueda, debido a que la diversidad química vegetal podría ofrecernos los antibióticos de amplio espectro que necesitamos con menor riesgo de desarrollo de resistencia.

    Dada la necesidad de hacer investigación para buscar nuevos antibióticos a partir de plantas y de la disponibilidad en la región Caribe colombiana de especies poco exploradas, en esta tesis doctoral se planteó el objetivo de evaluar la actividad antibacteriana de plantas nativas de esta región colombiana frente a cepas de cuatro bacterias escogidas dentro del grupo ESKAPE-E, que también hacen parte de la lista prioritaria de la Organización Mundial de la Salud (OMS), como son las bacterias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa, sensibles y resistentes a antibióticos. Estas bacterias poseen todos los mecanismos de resistencia bacteriana, que van desde la presencia de enzimas inactivadoras como las betalactamasas, pasando por la modificación de proteínas de membrana que impiden la permeabilidad, hasta la presencia de proteínas para el eflujo con disminución reducida de antibióticos en su sitio blanco de acción. La mortalidad a nivel mundial asociada directa o indirectamente a las infecciones causadas por estas bacterias podría alcanzar 10 millones de muertes/año para el año 2050 si no se toman las medidas de control y se crean nuevas alternativas de tratamiento farmacológico.

    El objetivo general de esta tesis doctoral se alcanzó con la preparación de 93 extractos etanólicos a partir de 56 especies vegetales de la región Caribe colombiana, seleccionadas a partir del Catálogo de Plantas y Líquenes de Colombia. Los extractos fueron evaluados contra una cepa sensible y una cepa resistente a carbapenemes de las bacterias E. coli, K.

    pneumoniae y P. aeruginosa, y una cepa sensible y una resistente a meticilina de S. aureus.

    La actividad fue evaluada por el método de microdilución en caldo, de acuerdo a como lo establecen los protocolos del Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI); para cada extracto se obtuvo el porcentaje de inhibición de la bacteria a una concentración de 512 µg/mL. A los extractos que alcanzaron un porcentaje de inhibición ≥90% se les determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) hasta una concentración límite de 512 µg/mL.

    Cuatro extractos fueron activos contra S. aureus sensible y resistente a meticilina (cepas ATCC y clínicas) con valores de CIM<100 µg/mL (Mammea americana L. semillas, Anacardium occidentale L. semillas, Maclura tinctoria (L.) D.Don ex Steud hojas y Mammea americana L. hojas); otros 12 extractos fueron activos con valores de CIM entre 128 y 512 µg/mL. Ninguno de los extractos ensayados fue activo contra las bacterias Gramnegativas evaluadas.

    En esta tesis doctoral se evaluó, por primera vez, la actividad antibacteriana contra las bacterias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa, sensibles y resistentes a antibióticos, de extractos etanólicos de 19 especies vegetales de la región Caribe colombiana (Brownea ariza Benth, Capparis odoratissima Jacq, Chamissoa altissima (Jacq.) Kunth, Dicliptera sexangularis (L.) Juss, Diospyros inconstans Jacq, Echinodorus paniculatus Micheli, Echinodorus tunicatus Micheli, Eleocharis elegans (Kunth) Roem. & Schult, Gustavia superba (Kunth) O.Berg, Hippomane mancinella L., Ludwigia helminthorriza (Mart.) H.Hara, Mimosa candollei R. Grether, Nymphaea novogranatensis Wiersema, Pereskia guamacho F.A.C.Weber, Ruellia blechum L., Ruellia paniculata L., Sagittaria intermedia Micheli, Sagittaria lancifolia L. y Utricularia foliosa L.). Solo tres de estas 19 especies (Ludwigia helminthorriza, Ruellia paniculata y Sagittaria intermedia) presentaron actividad contra S. aureus con una MIC de 512 µg/mL.

    Dos extractos con valor de CIM≤100 µg/mL fueron seleccionados para realizar el fraccionamiento biodirigido y aislamiento de metabolitos presentes en las fracciones activas.

    Los extractos de semillas de Mammea americana L. y de hojas de Maclura tinctoria (L.) D.Don ex Steud fueron fraccionados por diferentes métodos cromatográficos, tales como, cromatografía en columna, cromatografía de capa fina y cromatografía líquida de alta resolución; las fracciones fueron evaluadas contra la bacteria S. aureus, y de éstas fue posible aislar metabolitos secundarios activos cuya estructura química fue elucidada mediante Resonancia Magnética Nuclear 1D y 2D. A partir del extracto de las semillas de M.

    americana, que alcanzó una CIM de 2-4 µg/mL, se aislaron las cumarinas mammea B/BA, mammea B/BC, mammea A/AA cyclo D y mammea A/AA cyclo F y una mezcla de mammea B/BA cyclo F más mammea B/BD cyclo F. Entre las cumarinas aisladas mammea B/BA alcanzó una CIM de 0.5-1 µg/mL contra diferentes cepas de S. aureus. La toxicidad del extracto de M. americana y de la cumarina mammea B/BA, fue evaluada in vivo contra el nematodo Caenorhabditis elegans e in vitro contra los fibroblastos humanos, indicando baja toxicidad en ambos ensayos.

    Bajo la misma metodología de trabajo, el extracto de las hojas de M. tinctoria fue fraccionado y la actividad de las fracciones fue evaluada contra S. aureus. A partir de la fracción activa se aisló el metabolito activo 6,8-diprenilorobol, una isoflavona diprenilada, con una CIM de 8 µg/mL; además, se pudo identificar mediante análisis por HPLC-ESI-QTOF la presencia de otros flavonoides prenilados como ulexone B, wighteone, isoderrone, dinklagin B, dinklagin C y sigmoidin C. El valor de IC50 del compuesto activo 6,8-diprenilorobol, evaluado en fibroblastos MRC-5, fue >10 µg/mL.

    Por último, en esta tesis de doctorado se realizó el estudio fitoquímico del extracto etanólico de las semillas de Tabernaemontana cymosa Jacq que condujo al aislamiento de los alcaloides voacangina, voacangina 7-hidroxindolenina, 3-oxo-voacangina y rupicolina, los cuales fueron evaluados contra S. aureus. Voacangina fue el único alcaloide activo, alcanzando un valor de CIM de 64 µg/mL. La actividad in vitro fue complementada con un estudio in silico sobre las proteínas de S. aureus encontrando que voacangina se une preferentemente a PBP2 y PBP2a, proteínas implicadas en la síntesis de la pared celular.

    Aunque la actividad de los extractos de semillas de Mammea americana y hojas de Maclura tinctoria contra S. aureus, ya había sido reportada de manera preliminar en la literatura científica, el fraccionamiento biodirigido de los mismos y el aislamiento de los metabolitos activos junto con su evaluación biológica de sus extractos, para determinar sus valores de CIM contra estas bacterias, no había sido reportado, siendo esto último uno de los mayores aportes de nuevo conocimiento a la ciencia, de esta tesis doctoral. Por otra parte, en cuanto a los alcaloides indólicos de T. cymosa se refiere, esta es la primera vez que se evalúa la actividad de ellos contra S. aureus y se reporta la CIM de voacangina y la evaluación del resto de los alcaloides aislados en este trabajo.