Aproximación al modo de acción de hidrazonas derivadas de cromanos y sapogeninas como agentes leishmanicidas

• Autores: Yulieth Alexandra Upegui Zapata
• Directores de la Tesis: Luis Fernando Echeverri Lopez (dir. tes.), Sara María Robledo Restrepo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Antioquia ( Colombia ) en 2020
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • In vitro studies of Leishmania spp death caused by the combined application of Sapindus saponaria triterpene sapogenins and chroman´s derived hydrazones
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    La leishmaniasis es un problema de salud pública, que afecta países tropicales y subtropicales, esta enfermedad parasitaria transmitida por vectores tiene un amplio espectro clínico, que va desde una lesión auto limitada en piel, hasta la afectación en mucosas y vísceras. Actualmente, la principal problemática es la escasez de alternativas terapéuticas, la poca adherencia, efectos adversos y el surgimiento de resistencia a los medicamentos disponibles. Por ello, es necesario trabajar en la búsqueda de nuevas entidades químicas capaces de eliminar el parásito y regenerar el tejido afectado.

    Las hidrazonas derivadas de cromanos (TC1 y TC2) son compuestos a los que recientemente se les reportó una importante actividad antileishmania, demostrada en estudios tanto in vitro como in vivo. En el presente trabajo, se confirmó la citotoxicidad y efectividad in vitro sobre diferentes especies de Leishmania al igual que la eficacia terapéutica in vivo, así como también el modo de acción de las hidrazonas derivadas de cromanos solas y en mezcla con una saponina triterpénica extraída de Sapindus saponaria (SS).

    La citotoxicidad, varió dependiendo del tipo de célula, siendo menor cuando se evaluaron en combinación. Por su parte, los compuestos puros fueron más activos contra los amastigotes intracelulares de Leishmania, en comparación a los promastigotes y a los amastigotes axénicos. Los estudios in vivo mostraron que las mezclas de TC1 o TC2 con SS en proporción 1:1, lograron la curación en el 100% de los hámsters tratados, sin signos asociados de toxicidad.

    Se encontraron dos tipos de efectos ocasionados por las moléculas, los primeros directos sobre el parásito y los segundos indirectos definidos como alteraciones en la relación parásito-célula hospedadora. Igualmente se detectó que SS afecta directamente el metabolismo energético del parásito, siendo la mitocondria la diana principal, al encontrarse afectada su ultraestructura, el potencial de membrana y los niveles de ATP. La afectación mitocondrial que causan las hidrazonas solo se reflejo en pérdida de los niveles de ATP. Adicionalmente se demostró un aumento de la producción de ROS tras la administración de todas las moléculas, aumento que no pudo ser compensado en el tiempo. Contrario a lo esperado para moléculas del tipo saponina, no se encontró ningún efecto en la permeabilidad de membrana citoplasmática a las concentraciones ensayadas. Por último, la administración de TC1, TC2 y SS inhibió la actividad de proteasas de cisteína de L. braziliensis, pero en L. mexicana solo fueron inhibidas por SS. Se encontró actividad inhibitoria < 30% sobre la proteasa de cisteína catepsina B de L. braziliensis y L. donovani; esta última utilizada como control ya que se ha estudiado ampliamente esta proteasa en esa especie.

    La actividad inhibitoria de proteasas se relacionó con la pérdida de infectividad de los amastigotes tratados con todas las moléculas, el mayor efecto se obtuvo con TC1 donde la infectividad se disminuyo en un 68%. La acción indirecta se asoció con la alteración en la relación parásito - macrófago en diferentes aspectos; reducción de la voluminosidad del fagolisosoma al tratamiento con las hidrazonas de cromano, pero sin cambio en el pH del compartimiento ni el número de lisosomas. Con la aplicación de mezclas, estos compartimientos ácidos se ubicaron juntos dentro de la célula sugiriendo una mayor actividad oxidativa. Todos los tratamientos causaron un aumento de la producción de Oxido Nítrico (NO), en macrófagos infectados y tratados, consolidando así un cambio en el fenotipo del macrófago (pro-inflamatorio), lo que favorece la eliminación del patógeno, siendo el efecto mucho más rápido y de mayor intensidad con TC1 y TC2.

    Aproximaciones metabolómicas apoyan la hipótesis de esta conversión a fenotipo inflamatorio de los macrófagos infectados tratados, al reprimirse la acumulación en el medio de IA3 (ácido 3-indol-acético), metabolito inhibidor de la respuesta inflamatoria, el cual es secretado en células infectadas exclusivamente. El tratamiento con SS afectó el metabolismo del triptófano, desfavoreciendo el desarrollo intravacuolar de Leishmania, ya que el parásito es auxótrofo, esto podría explicar el efecto parasitostático observado. Las hidrazonas afectan también el metabolismo del triptófano evitando la producción de I3A y 5-HIAA.

    Este estudio, permitió demostrar el potencial terapéutico de un producto constituido por la mezcla de TC1 o TC2 y SS, para el tratamiento de la leishmaiasis cutánea causada por L. braziliensis. Este efecto curativo se debe a la capacidad de estos compuestos para afectar la supervivencia del parásito a nivel intravacuolar y bloquear su capacidad para infectar nuevas células.

  • English

    Currently, there are few therapeutic alternatives for the treatment of Leishmaniasis. Therefore, the search for new molecules capable of eliminating the parasite and regenerating the affected tissue is a priority. In this work, the action mode of hydrazones compounds derived from chromane (TC1, TC2), and mixtures of triterpene saponins (SS, extracted from Sapindus saponaria) was determined. To that, in vitro effects on different species of Leishmania as well as in vivo therapeutic efficacy were carried out. The cytotoxicity of the compounds varied depending on the cell type, b+eing lower when they were evaluated in combinations. On the other hand, the compounds were more active against Leishmania's intracellular amastigotes than axenic promastigotes and amastigotes. In vivo studies showed that combinations of TC1 or TC2 with SS in 1:1 amount achieved healing in 100% of treated hamsters, without signals associated with toxicity.

    A direct effect on the parasite's energy metabolism was detected, and mitochondria was the primary target. Changes in its ultrastructure and mitochondrial membrane potential were observed with SS administration. Besides, there was a loss of ATP caused by chromane hydrazones, and increased production of ROS after treatment administration; the parasite did not compensate for this increase during the time of the assay. Contrary to expectations, no effect was found on cytoplasmic membrane permeability. Similarly, the administration of compounds inhibited the activity of cysteine protease both L. mexicana and L. braziliensis. Besides, there was a slight action on the activity of cathepsin B of L. donovani and L. braziliensis. These findings possibly were related to losing the infectivity of the parasites. An indirect action was also detected, which related to the alteration in the parasitemacrophage ratio in different respects, such as reducing the volume of the phagolysosome with the administration of the chromane hydrazones, but there was no change in the pH of the compartment or the number of lysosomes. Production of ON was increased in macrophages infected and treated with substances, suggesting changes in the phenotype of macrophage (pro-inflammatory), which facilitates the elimination of the pathogen. Several metabolic approaches support this conversion, for example, inhibition of IA3 excretion by SS and TC1, as this is an inhibitory metabolite of the inflammatory response, which is excreted in the infected cells exclusively. Also, different metabolic pathways were affected that prevent the intra-vacuolar development of Leishmania, such as tryptophan and arginine. Likewise, there was a blockage in the uptake of other amino acids and purines, metabolites for which the parasite is mostly auxotrophic. All this consolidates a parasitostatic effect. This work shows the potential of this combination therapy for the treatment of cutaneous Leishmaniasis, caused by several species. The healing effect seems to be due quite possibly to the ability of the compounds applied to affect the survival of the parasite at the intravacuolar level, blocking its ability to infect new cells.