Resumen de Identificación de biomarcadores de resistencia a taxanos en cáncer de cabeza y cuello. Estudio de alternativas terapéuticas
- español
El carcinoma escamoso de cabeza y cuello incluye un grupo heterogéneo de neoplasias con origen en el epitelio escamoso del tracto aerodigestivo superior. Una de las opciones terapéuticas cuando el tumor es irresecable y se diagnostica en estadios localmente avanzados es la quimioterapia de inducción con taxanos, platinos y 5-fluorouracilo (régimen TPF) seguida de radioterapia. A pesar de la mejora en la supervivencia observada en los últimos años, existen subgrupos de pacientes que presentan resistencia al tratamiento y mal pronóstico.
Por este motivo, los objetivos principales de este trabajo fueron caracterizar las alteraciones moleculares asociadas al carcinoma escamoso de cabeza y cuello resistente a taxanos e identificar alternativas terapéuticas. Se emplearon tres líneas celulares derivadas de carcinomas escamosos de lengua (CAL33), laringe (32860) y orofaringe (32816) y se indujo la resistencia a paclitaxel mediante el incremento progresivo de dosis, estableciéndose dos líneas celulares resistentes a taxanos (CAL33-R y 32816-R). Sin embargo, la línea celular 32860 no adquirió resistencia a paclitaxel. Esta línea celular presenta una deleción en la región distal del brazo cromosómico 3p que afecta al gen ATG7 y una inhibición del proceso de autofagia. Con el objetivo de determinar si esta alteración era responsable de la ausencia de adquisición de resistencia a paclitaxel, se inactivó el gen ATG7 en la línea celular 32816 mediante la tecnología CRISPR/Cas9, generando clones knockout para ATG7. En estos clones se observó un bloqueo de la autofagia, una menor sensibilidad a paclitaxel y una adquisición de resistencia a paclitaxel más rápida. De este modo, la inactivación de ATG7 causa un bloqueo de la autofagia, pero no es la responsable del comportamiento diferencial de la línea celular 32860.
Se definió el perfil genómico de una serie de 177 carcinomas escamosos de cabeza y cuello diagnosticados en estadios localmente avanzados y se asociaron las alteraciones encontradas con la respuesta al régimen TPF. Los tumores de los pacientes con toxicidad al tratamiento presentaron un mayor número de cambios genómicos. Las pérdidas en 4p fueron más frecuentes en este grupo, sugiriendo que esta alteración podría determinar la toxicidad a la terapia TPF. Además, se analizó la región 3p25.3, donde se encuentra el gen ATG7, y se identificaron deleciones en un 64,4% de los casos en la serie global, de modo que esta es una alteración recurrente en el carcinoma escamoso de cabeza y cuello.
Por otra parte, en las líneas celulares CAL33-R y 32816-R se identificó la sobreexpresión de ABCB1, que codifica MDR1, una bomba de expulsión de fármacos, y la infraexpresión de DNAJC15, que codifica MCJ, un regulador negativo de la respiración mitocondrial. Se demostró que estas alteraciones son esenciales para la resistencia a taxanos en estas líneas celulares, identificando así un posible biomarcador predictivo de la respuesta conjunto. El mecanismo subyacente a esta resistencia podría basarse en un aumento de la producción de ATP mitocondrial, debido a la pérdida de expresión de DNAJC15, que podría ser empleado por la bomba de eflujo MDR1, capaz de expulsar el fármaco reduciendo la concentración intracelular y el efecto del mismo. La caracterización del fenotipo de las líneas celulares CAL33-R y 32816-R reveló una disminución de la proliferación y un aumento de la capacidad migratoria. Además, se analizó el papel de las vesículas extracelulares en la resistencia a taxanos. Se identificaron diferencias en el contenido proteico de las vesículas liberadas por las líneas celulares CAL33 y CAL33-R que ponen de manifiesto la posible transferencia de la resistencia a otras células tumorales mediante este mecanismo.
Finalmente, se estudió la respuesta de las líneas celulares resistentes a taxanos a otras terapias. Estas líneas celulares mantuvieron la respuesta a 5-fluorouracilo y mostraron un incremento de sensibilidad a agentes inductores de daño en el DNA, incluyendo el cisplatino y la radiación. El motivo de esta sensibilidad cruzada es un aumento en los niveles de daño en el DNA junto con alteraciones en las vías de reparación de este daño. Teniendo en cuenta esto, se estudió la respuesta a olaparib, un inhibidor de la reparación del daño en el DNA, y se observó que las células resistentes a taxanos también mostraban una mayor sensibilidad a este fármaco. Por último, se analizó la respuesta a un agente antimitótico análogo de la combretastatina A4 y se observó una elevada respuesta en todas las líneas celulares, incluyendo las resistentes a taxanos.
- English
Squamous cell carcinoma of the head and neck includes a heterogeneous group of neoplasms originated in the squamous epithelium of the upper aerodigestive tract. One of the therapeutic options for unresectable tumours diagnosed in locally advanced stages is induction chemotherapy with taxanes, platinums and 5-fluorouracil (TPF regimen) followed by radiotherapy. Despite the improvement in survival observed in recent years, there are subgroups of patients who present resistance to treatment and poor prognosis.
For this reason, the main objective of this work was to characterize the molecular alterations associated with taxane-resistant head and neck squamous cell carcinoma. Paclitaxel resistance was induced in three cell lines derived from squamous carcinomas of the tongue (CAL33), larynx (32860) and oropharynx (32816) by step-wise dose increase, establishing two taxane-resistant cell lines (CAL33-R and 32816-R). However, the 32860 cell line did not acquire resistance to paclitaxel. This cell line presents a deletion in the terminal region of chromosome arm 3p that affects the ATG7 gene and causes an inhibition of autophagy. In order to determine whether this alteration was responsible for the lack of acquisition of paclitaxel resistance, the ATG7 gene was inactivated in the 32816 cell line using CRISPR-Cas9 technology, generating ATG7 knockout clones. In these clones, autophagy blockade, decreased sensitivity to paclitaxel and faster acquisition of paclitaxel resistance were observed. Thus, inactivation of ATG7 inhibits autophagy, but is not responsible for the differential behaviour observed in the 32860 cell line.
The genomic profile of a series of 177 head and neck squamous cell carcinomas diagnosed at locally advanced stages was defined and the alterations found were associated with the response to the TPF regimen. Tumours from patients with toxicity to treatment presented a greater number of genomic changes. Losses in 4p were more frequent in this group, suggesting that this alteration could determine toxicity to TPF therapy. In addition, the region where ATG7 is located was analyzed and deletions were identified in 64.4% of the cases in the overall series, so this is a recurrent alteration in head and neck squamous cell carcinoma.
Moreover, overexpression of ABCB1, encoding MDR1, a drug efflux pump, and underexpression of DNAJC15, encoding MCJ, a negative regulator of mitochondrial respiration, were identified in CAL33-R and 32816-R cell lines. These alterations were shown to be essential for taxane resistance in these cell lines and taken together could constitute a potential response biomarker. Phenotype characterization of CAL33-R and 32816-R cell lines revealed decreased proliferation and increased migratory capacity probably due to dysregulation of key signalling pathways in these processes. In addition, the role of extracellular vesicles in taxane resistance was analyzed. Differences in the protein content of vesicles released by the CAL33 and CAL33-R cell lines were identified, highlighting the possible transfer of resistance to other tumour cells using this mechanism.
Finally, the response of taxane-resistant cell lines to other therapies was studied. These cell lines retained the response to 5-FU and showed increased sensitivity to DNA-damaging agents, including cisplatin and radiation. The reason for this cross-sensitivity is an increase in the levels of DNA damage together with alterations in DNA repair pathways. The response to olaparib, an inhibitor of DNA damage repair, was studied and it was observed that taxane-resistant cells also showed increased sensitivity to this drug, that should be considered as a therapeutic alternative.
The results obtained suggest that ATG7 could condition taxane response in head and neck squamous cell carcinoma. Furthermore, ABCB1 overexpression together with DNAJC15 underexpression could be a biomarker of taxane response, determining the existence of resistance to treatment. The mechanism underlying this resistance could be based on an increase in mitochondrial ATP, production due to the loss of DNAJC15 expression, used by the efflux pump MDR1 to expel the drug, reducing its intracellular concentration and effect. The combination of DNA-damaging agents with DNA repair inhibidors could constitute an effective therapeutic alternative in taxane-resistant head and neck squamous cell carcinoma.
