Expresión y producción de la lacasa POXA 1B recombinante de pleurotus ostreatus como alternativa para el tratamiento de los subproductos líquidos que se obtienen en el proceso de blanqueamiento de pulpa de celulosa

• Autores: Claudia Marcela Rivera Hoyos
• Directores de la Tesis: Raúl Poutou Piñales (dir. tes.), Aura Marina Pedroza-Rodríguez (dir. tes.)
• Lectura: En la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ) ( Colombia ) en 2016
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  hdl.handle.net  doi.org 
• Resumen
  • español

    "Las lacasas están generando un gran interés debido a sus potenciales aplicaciones en biotecnología. Son oxidasas multicobre que catalizan compuestos aromáticos y no-aromáticos, con la subsecuente reducción del oxígeno molecular a agua. En el presente trabajo se seleccionó el gen codificante para la lacasa POXA IB del hongo Pleurotos ostreatos. Este gen se optimizó para el uso de codones en Pichia pastons, contenido de GC y regiones que generen estructuras secundarias. Se evaluó la interacción del modelo computacional obtenido y su interacción con el sustrato ABTS [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-ácido sulfónico)] realizando un docking molecular. Luego de realizar un diseño experimental Plackett-Burman, seguido de un diseño One Factor, se obtuvo una actividad lacasa de 1,343.52 ± 40.3 UL'1 a las 168h de cultivo en frascos de 500mL. El sobrenadante concentrado conteniendo la enzima POXA IB mantuvo su estabilidad entre 10-50 °C y retuvo más del 70% de la actividad enzimática residual a 60°C y del 50% a 70°C. Adicionalmente, la enzima fue más estable a pH 4 ± 0.2 con una actividad residual de más del 90%. La actividad residual más baja del 60% se obtuvo a pH 10 ± 0.2. Adicionalmente, los parámetros cinéticos fueron Vmax de 3.163 x 10'2 mM s""1, y Km de 1.720 mM. La decoloración del licor sintético a los 5 días de tratamiento fue de 19, 53 y 59%, para las concentraciones de licor de 10, 5 y 1% (v/v), y la remoción de DQO de 5, 30 y 53%, respectivamente, con actividades lacasa de 1399, 1346 y 1327 UL'1 para cada una de las concentraciones evaluadas. Toda esta información reunida, puede considerarse como hallazgos importantes a la luz de la expresión de enzimas recombinantes para su uso en sistemas ambientalmente amigables, debido al amplio rango de sustratos que pueden ser transformados por las lacasas. Contribuyendo a una gran gama de productos en diversos entornos: la industria, el uso clínico y química y aplicaciones ambientales."

  • English

    "Laccases are generating a great interest clue to their biotechnological potential applications. They are multicopper oxidases that catalyze aromatic and non-aromatic compounds, concomitantly with molecular oxygen reduction to water. In this work was selected the encoding gene for POXA IB laccase from the fungus Pleurotus ostreatus. This gene was optimized for codon use in Pichia pastoris, GC content, and regions generating secondary structures. Laccase proposed computational model, and their interaction with ABTS [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)] substrate was evaluated by molecular docking. After using a Plackett-Burman Design followed by a One Factor it was obtained a laccase activity of 1,343.52 ± 40.3 UL'1 at 16Sh of culture in a 500 inL shake-flask. Tire concentrated supernatant, containing the POXA IB enzyme, remained stable between 10 and 50°C and retained over 70% residual enzymatic activity at 60°C and 50% at 70°C. Besides the enzyme was more stable at pH 4 ± 0.2 with a residual activity greater than 90%. The lowest residual activity of 60% was obtained at pH 10 ± 0.2. Furthermore, kinetic parameters were Vmax of 3.163 x 10""2 mM s""1 and Km of 1.720 mM. The decolorization of synthetic black liquor at 5 days of treatment was 19, 53 y 59%, for 10, 5 y 1% (v/v) liquor concentrations, and the DQO removal 5, 30 y 53%, respectively, with a lacase activity of 1399, 1346 y 1327 UL""1 for each different concentration. All this information together can be considered as important findings in light of recombinant enzyme expression system utility for environmentally friendly designed expression systems, because of the wide range of substrates that laccases can transform. Contributing to a great gamut of products in diverse settings: industry, clinical and chemical use, and environmental applications."