Anàlisi funcional de la regió N-terminal de l'HMG-CoA reductasa d'Arabidopsis
- Autores: Pablo Leivar Rico
- Directores de la Tesis: Narciso Campos Martínez (dir. tes.), Albert Boronat (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2004
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Albert Ferrer Prats (presid.), Santiago Imperial Ródenas (secret.), Maria Dolors Ludevid Múgica (voc.), Adrews Phillips Michael (voc.), Xavier Fernández Busquets (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
Les plantes sintetitzen una gran varietat de compostos isoprenoides a través duna ruta metabòlica complexa i ramificada. Lenzim HMG-CoA reductasa (HMGR) catalitza la conversió dHMG-CoA en mevalonat, una etapa limitant de flux per la biosíntesis disoprenoides en el citosol-reticle endoplasmàtic (RE). En totes les espècies de plantes analitzades existeixen vàries isoformes dHMGR codificades per petites famílies multigèniques. En el cas dArabidopsis, existeixen dos gens ("HMG1" i "HMG2") que codifiquen per tres isoformes de lenzim: HMGR1L, HMGR1S i HMGR2. Múltiples estudis suggereixen que les isoformes dHMGR de plantes estarien implicades en la síntesi disoprenoides particulars. Aquest model despecialització funcional de les isoformes dHMGR està basat en estudis dexpressió gènica en diferents estadis del desenvolupament o en resposta a diferents estímuls. Tot i així, a linici daquesta tesi, no es tenien dades contrastades de la distribució de les isoformes dHMGR en diferents teixits ni de la seva distribució subcellular. Aquest darrer aspecte era particularment interessant, doncs shavia suggerit que lespecialització funcional de les isoformes dHMGR podria venir determinada, en part, per diferències en la seva localització subcellular.
Amb aquests antecedents, es va iniciar un estudi de la distribució tissular i subcellular de les diferents isoformes dHMGR dArabidopsis. Mitjançant assaigs de western blot utilitzant anticossos generats contra el domini catalític de lenzim, es va comprovar que les isoformes HMGR1S i HMGR1L es distribuïen de manera diferencial en teixits dArabidopsis, fet que es correlacionava amb els estudis previs dexpressió dels gens corresponents. Tanmateix, estudis de fraccionament subcellular a partir de cèllules de la línia T87 van demostrar que aquestes isoformes es trobaven en fraccions diferents: si bé lHMGR1S es trobava bàsicament en una fracció que sedimenta a 16.000xg, lHMGR1L senriquia en una fracció que sedimenta a 105.000xg. Estudis de localització subcellular emprant fusions amb la proteïna fluorescent verda (GFP) van determinar que, si bé la isoforma HMGR1S es localitza principalment en estructures vesiculars de 0.5-2 mi/m, la isoforma HMGR1L es troba exclusivament en el RE. Aquesta localització subcellular diferencial entre ambdues isoformes ve determinada per la presència duna extensió N-terminal de 50 aminoàcids (1Lextra) en la isoforma HMGR1L. Per tant, la regió N-terminal citosòlica constitueix una regió que determina la localització subcellular de lenzim, funció que ha de venir mediada per proteïnes que hi interaccionin específicament. Amb lobjectiu de cercar proteïnes que interaccionin amb la regió N-terminal citosòlica de lHMGR1L, es va realitzar un crivellatge per doble híbrid duna genoteca dexpressió dArabidopsis. Daquesta manera, es van identificar les proteïnes PR2A1, PR2A2 i KLC1, i es va procedir a la seva caracterització. Duna banda, es va verificar que PR2A1 i PR2A2 eren subunitats reguladores B de la proteïna fosfatasa 2A (PP2A). Tanmateix, es va determinar que PR2A1 i PR2A2 interaccionaven selectivament amb la regió N-terminal citosòlica de les isoformes HMGR1L i HMGR1S, però no amb la de lHMGR2. Finalment, es va constatar que la interacció de les isoformes HMGR1L i HMGR1S amb la PR2A1 és modulada per calci. Les dades suggereixen que la PP2A podria formar part de la cascada de senyalització subcellular que permetria ajustar lactivitat HMGR als estímuls ambientals i de desenvolupament. Daltra banda, es va constatar que KLC1 presentava similitud amb la cadena lleugera de quinesina de tipus I, i en conservava una estructura modular equivalent. A més, es va determinar que KLC1 interacciona amb la regió N-terminal citosòlica de la isoforma HMGR1L, però no amb la de lHMGR1S ni lHMGR2. També es va comprovar que la regió 1Lextra, que determina la localització de lHMGR1L en el RE, és imprescindible per aquesta interacció. Aquest fet suggereix que KLC1 podria jugar un paper en la localització subcellular de la isoforma HMGR1L.
En conjunt, les dades de localització subcellular i dinteracció amb les proteïnes PR2A1, PR2A2 i KLC1, permeten postular un model despecialització funcional de les isoformes HMGR1S i HMGR1L en el qual la biosíntesis de mevalonat es produiria segregada en dos compartiments subcellulars: el RE i les estructures vesiculars, les quals constituirien un nou compartiment de biosíntesis disoprenoides en plantes.
