Replicación y morfogénesis de astrovirus
- Autores: Santiago Caballero Diez
- Directores de la Tesis: Albert Bosch i Navarro (dir. tes.), Rosa María Pintó Solé (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2005
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Javier Buesa Gómez (presid.), Susana Guix Arnau (secret.), Ignacio Calicó Bosch (voc.), María Pirón (voc.), Núria Verdaguer Massana (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
La tesis doctoral trata aspectos básicos de la biología de los astrovirus. Los astrovirus son virus sin envuelta lipídica, con un genoma de ARNmc de polaridad positiva y de entre 28 y 43 nm de diámetro. Son agentes causales de gastroenteritis sobretodo en la población infantil. Los trabajos realizados se centran en la replicación y morfogénesis de estos virus.
En primer lugar, nos propusimos determinar las cargas víricas excretadas en las heces de niños con gastroenteritis causados por astrovirus con el fin de darnos una idea de cual era la capacidad replicativa de estos virus en su huésped natural. Para ello, se puso a punto una técnica molecular para la cuantificación de virus y se aplicó en un estudio epidemiológico realizado con anterioridad en el área metropolitana de Barcelona entre los años 1997 y 2002. El resultado obtenido fue que los niveles de carga vírica detectados eran diferentes en función del genotipo del virus, siendo los genotipos IV-C y V-D los que presentan mayores niveles de virus excretados en heces.
En segundo lugar, decidimos profundizar en el papel de la proteína nsP1a/4 de astrovirus en la replicación del genoma vírico y en la producción de progenie vírica. Estudios previos ya apuntaban hacia esta relación, aunque en ningún caso se había demostrado. De este modo, la estrategia a seguir fue construir diferentes clones de astrovirus que sólo se diferenciasen en la zona codificante para la proteína nsP1a/4 y cuantificar la síntesis de los diferentes ARN víricos y producción de progenie vírica en cultivo celular. Los resultados obtenidos confirmaron nuestras hipótesis ya que las diferencias en la secuencia de la proteína nsP1a/4 se traducen en una capacidad de replicación del genoma vírico y de producción de progenie vírica diferencial en función del genotipos del virus. Además los resultados indican que el patrón de fosforilación de la proteína está relacionado con la estrategia de replicación del virus.
Los datos obtenidos en estos dos estudios pueden ser importantes a la hora de decidir una estrategia en el tratamiento de las gastroenteritis causadas por astrovirus en función del genotipo del virus, así como si la puesta a punto de una vacuna frente astrovirus estuviese justificada.
Finalmente, los pocos trabajos, y al mismo tiempo contradictorios, realizados sobre la morfogénesis de astrovirus, nos animó a profundizar un poco más en su estudio.
En nuestro caso, la estrategia seguida fue obtener partículas virus-like (VLPs) y trabajar con ellas como modelo del virus. Nuestro trabajo se centró en estudiar la importancia del extremo amino-terminal de la poliproteína estructural en el ensamblaje de la cápside así como el papel de los iones divalentes en la estabilidad de las cápsides. Los resultados mostraron que a pesar que el extremo amino-terminal no es imprescindible, éste no es eliminado en el ensamblaje de las cápsides y se obtienen unas VLPs de 38 nm de diámetro. Además se observó que la adición de agentes quelantes de iones divalentes en la purificación de VLPs en gradientes de CsCl hace que éstas se desestabilicen dando lugar a la aparición de un estado morfogénico intermedio (anillos de 16 nm) en el ensamblaje de las cápsides. Este fenómeno de desestabilización es reversible si se elimina el agente quelante y se añaden iones divalentes. Todos estos resultados, junto con un análisis computacional de la estructura tridimensional de la poliproteína estructural nos hacen pensar que la morfogénesis de astrovirus seguiría un modelo similar al de calicivirus basándose en el dímero de proteínas como unidad estructural del virus.
"ENGLISH ABSTRACT:
This thesis studies some topics about replication and morphogenesis of astrovirus. The astroviruses are non-enveloped, (+) ssRNA viruses of 28-43 nm in size. They are causal agents of gastroenteritis on children.
First, we determined the level of viral loads excreted in faeces by children infected with astrovirus. For this purpose, a competitive RT-PCR was developed and applied to samples derived from an epidemiological study. The results showed that the level of viral loads depends on the virus genotype, being the genotypes IV-C and V-D the ones with highest viral loads excreted.
Immediately, we studied the role of nsP1a/4 protein in virus replication. For this purpose, three clones of astrovirus, which only differed in the coding region of nsP1a/4 protein, were constructed; and quantification of viral RNA synthesis and virus production for each clone was performed. The results showed that the different clones had different replication strategy, and this fact could be only attributed to the biological properties of nsP1a/4 protein. In addition, the phosphorylation of this protein seems to be related with its regulation.
Finally, virus-like particles were obtained and used as a virus model for morphogenesis studies. The results showed that the N-terminal region of the structural polyprotein is not necessary for capsid assembly and VLPs of 38 nm in size were observed. In addition, we stated that the presence of EDTA disrupt the VLPs into smaller structures (rings of 16 nm in size) when they are purified in CsCl gradients. This phenomenon is reversible if the EDTA is removed and divalent cations are added. As a conclusion of the work with VLPs , we consider that morphogenesis of astrovirus could be explained according to the calicivirus model based in a protein dimmer as structural unit of the virus."
