Protocolos molecular y celular para elaborar y determinar una cepa vacunal de salmonella enterica serotipo enteriditis 82139 y propuesta de tipos de biorreactores para su produccion

• Autores: Liliana Verónica Villanueva Alva
• Directores de la Tesis: Raúl Antonio Beltrán Orbegoso (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Trujillo ( Perú ) en 2016
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    Se presenta Protocolos Molecular y Celular para Elaborar y Determinar una cepa vacunal de Salmonella entérica Serotipo Enteritidis 82139 y Propuesta de Tipos de Biorreactores para su Producción. El Diseño Factorial permitió en un inicio los diseños y selección para la construcción de cepas mutantes hasta la validación estadística en la determinación de la función génica de dsbA, dle y dlp con respecto a la capacidad de movilidad y de invasión intracelular bacteriana a partir de la determinación de Diferencia Mínima significativa (DMS) en estas funciones y con un 99% de nivel de confianza para movilidad y un 95% para invasión intracelular bacteriana. Las cepas obtenidas fueron: simples mutantes 82139 C, 82139 I, 82139 2; dobles mutantes 82139 2C, 82139 2I y 82139 CI. y la triple mutante 82139 2CI, con 02 cepas adicionales de control de expresión de dle :82139 2CI pSTB1dle y 82139 pSTB1. Para la construcción y obtención de las cepas mutantes se usaron las técnicas de Ingeniería Genética, tales como: PCR Star, Electroforesis, Electrolución, Secuenciación automatizada, Clonación, Extracción plasmídica miniprés y maxiprés de vectores monocopia y multicopia, Recombinación genética por Transformación y Transducción. Titulación de fagos, Construcción de vectores, Técnicas de Interrupción y Complementación génica. Además para la Producción a mayor escala de preinóculos e inóculos bacterianos de cepas vacunales se propone el uso de Biorreactores; para preinóculos el tipo de Biorreactor Loop de Circulación Interna, Flujo invertido (con sistema de aireación y con Agitador tipo Hélice) con Cortador de Espuma (BLIIHC - 11) y para la Producción de inóculos bacterianos: de cepas vacunales, se propone el Modelo de Biorreactor Tipo Loop de Circulación Interna, sin Flujo Invertido (sin sistema de aireación y sin Agitador Hélice) pero sí con un Cortador de Espuma modificado (BLIIHC -10). El trabajo establece las bases de la Propuesta de Protocolos Celulares para determinaciones in vitro tanto de la capacidad de movilidad, como para la determinación de la capacidad de invasión bacteriana en líneas celulares Henle 407 y MDCK que permitieran el éxito a futuro de los ensayos in vivo. La prueba de movilidad fue realizada en agar movilidad al 0,3% de agar sembrado por el método de puntura en placa y leídas luego del proceso de incubación a 37°C durante 36 horas. La prueba de invasión bacteriana de tipo intracelular no sistémico fue realizada por infección en monocapas de células MDCK y Henle 407 determinada a 1, 2 y 4 horas de interacción bacteria - célula huésped. En Salmonella entérica Serotipo Enteritidis 82139 portadora de plásmido se determinó que : la proteína DsbA presenta una función determinante en la movilidad y en la invasión bacteriana. En ambas funciones se presenta una función complementaria de Dlp a DsbA; Dle tendría una función TDOR específica y limitada, relacionada solo con la capacidad de invasión bacteriana y asociada con la biosíntesis de fimbrias SEF y posiblemente de algunas proteínas de virulencia. Dle no tiene efecto en la movilidad. A pesar que DsbA, Dlp y Dle no tienen función en el crecimiento de la bacteria las mutantes presentan aletargado el tiempo de crecimiento. La prueba de movilidad fue determinada con un nivel de significancia de un 1% de error y la prueba de invasión bacteriana fue determinada con un nivel de significancia de 5%. El Diseño Factorial, el análisis de Varianza ANAVA y Diferencia Mínima Significativa (DMS) permiten también validar los resultados de los ensayos in vitro con coeficientes de Variación de 4.96% obtenidos en los ensayos de movilidad y de 3.93% en los ensayos de capacidad invasiva, comparado con un límite de aceptabilidad del 30%, lo que indican una buena calidad en la obtención de datos, resultados importantes para la determinación de la aplicación de nuevas vacunas que permita disminuir la forma agresiva de invasión en células de mamífero, y del retraso en su capacidad infectiva que se vea afectada su supervivencia y multiplicación de las bacterias invasivas – internalizadas, tiempo necesario en que se permita la pronta respuesta inmune de la célula huésped. Los ensayos in vitro de movilidad y de capacidad invasiva permiten relacionar la función Tiol periplásmica vía oxidativa (TDOR) de DsbA, Dlp y Dle con la funcionalidad de los factores de virulencia. Se determinó que estos ensayos in vitro apoyarán al éxito de los ensayos de infecciones in vivo utilizados en la determinación de una cepa vacunal. Se propone de ensayos adicionales in vivo para confirmar del uso como cepas vacunales a Salmonella entérica Serotipo Enteritidis 82139 2C y a 82139 2CI de tipo: vacuna viva y atenuada en su virulencia. Y se deberá tener en cuenta para los futuros estudios in vivo de la forma de administración de este producto, como lo reportado por Lohmann Animal Health. 2010, que propone ser administrados en agua de bebida o por aspersión. La cepa doble mutante 82139 2C, carente de los genes dsbA y dlp y la triple mutante 82139 2CI carente de los genes dsbA, dlp y dle, se constituyen en potenciales recursos genéticos para ser usados como cepas vacunales; debido a que inactivados los genes mencionados no codifican proteínas de virulencia activas, del que se ve reducida su capacidad de virulencia de la bacteria, por lograrse atenuar la inducción del correcto plegamiento y/o transporte de: proteínas de virulencia, fimbrias y flagelos, afectado el correspondiente ensamblaje, translocación y/o inserción de: flagelinas, adhesinas e invasinas, que presenten uno o más residuos de cisteína.

  • English

    A molecular and Cellular procedures is proposed to obtain alive attenuated no virulent strains from Salmonella entérica Seroype Enteritidis 82139, as a vaccine elaboration model and production scale bioreactor models as well. Initially, a factorial design allowed the mutant strains selection, which facilitated the genetic role of dsbA, dle y dlp genes in the bacterial motility and invasiveness activities. and with a 99% level of confidence for mobility and 95% for intracellular bacterial invasion. It was obtained the single mutant strains 82139 C, 82139 I, 82139 2; the double mutant strains, they are 82139 2C, 82139 2I y 82139 CI, and a triple mutant 82139 2CI. As dle gen expression control strains were used the following : 82139 2CI pSTB1dle y 82139 pSTB1. That strains belong to the Laboratory of Microbiology II the Complutense University the Madrid. To obtain and construct the mutant strains , it was used several genetic engineering tools such as PCR, electrophoresis, electroelution, sequencing, cloning, minipres and maxipres mono and multicopy plasmid extraction, transformation and transduction, fage doses, vector construction and genic complementation and recombination techniques. In addition to production to larger scale preinoculos and bacterial inocula of vaccine strains is proposed the use of bioreactors; for preinoculos type of Biorreactor Loop of internal circulation, flow invested (with aeration system and propeller type agitator) and cutter foam (BLIIHC - 11) and for the production of bacterial inoculum: vaccine strains, it is proposed the model of bioreactor type Loop of internal circulation, without flow reversal Given the fact that the triple mutant y double mutant, in absence of the three TDOR proteins, did not show motility and a limited invasive capacity below a infective doses in vivo, it can proposed Salmonella enteritidis 82139 2CI and 82139 2C as a susceptible resource of being investigated by means of immunologic assays to determine their possible use as straint alive attenuated vacunal no virulent. in that allowed the successful future of the in vivo tests... The Test in vitro motility test was performed in 0,3% motility agar slants by the sting method in badge. The bacterium invasive capacity and motility decreased in the single and double mutants and decreased ostensibly more in the triple mutants 2CI in absence of the TDOR proteins : DsbA, Dlp, y Dle. It was probed that the DsbA protein determined the motility and invasive capacity, and the complementary function of the Dlp to DsbA; Dle shows only specific and limited function TDOR, associated with the fimbrias biosynthesis SEF operon and possibly of some proteins of virulence. Dle doesn't have effect in the mobility. Despite that DsbA, Dlp and Dle have no function in the growth of the bacterium the mutants have sluggish growth time.The Test in vitro the invasive capacity in was carried out by infection in monocapas of cells MDCK and certain at 1, 2 and 4 hours. The in vitro motility and invasiveness tests allowed relating DsbA, Dlp y Dle Tiol periplasmic oxidative path (TDOR) function to the role of virulence factors. Motility assay was determined to 1% statistical significance level and invasiveness to 5% statistical significance level. El Diseño Factorial, el análisis de Varianza ANAVA y Diferencia Mínima Significativa (DMS) permiten también validar los resultados de los ensayos in vitro con coeficientes de Variación de 4.96% obtenidos en los ensayos de movilidad y de 3.93% en los ensayos de capacidad invasiva, comparado con un límite de aceptabilidad del 30%, lo que indican una buena calidad en la obtención de datos, resultados importantes para la determinación de la aplicación de nuevas vacunas que permita disminuir la forma agresiva de invasión en células de mamífero, y del retraso en su capacidad infectiva que se vea afectada su supervivencia y multiplicación de las bacterias invasivas – internalizadas, time required to allow the early immune response of the host cell. The double mutant 82139 2C missing dsbA y dlp genes and the triple mutant 82139 2CI missing dsbA, dlp y dle genes became potencial genetic resources to be used as vaccinal strains; for those genes code for the proteins TDOR: DsbA, Dlp and Dle, in charge of inducing correct folding and/or transport of the proteins of virulence, fimbria and flagella with the right assemblage, translocation and/or insertion of their proteins such as invationins, adhesionins, and flagelins respectively, containing one or more cystein moieties.