Estudio de heterorresistencia antibiótica, regulación epigenómica e inactivación génica programable durante la infección respiratoria por Haemophilus influenzae

• Autores: Celia Gil Campillo
• Directores de la Tesis: Juncal Garmendia Garcia (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2024
• Idioma: español
• Número de páginas: 333
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología por la Universidad Pública de Navarra
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Academica-e
• Resumen
  • español

    Este trabajo de Tesis Doctoral aborda tres aspectos clave en el estudio de la infección respiratoria por el patógeno oportunista Haemophilus influenzae, centrados en mecanismos alternativos a la resistencia antibiótica asociados al fallo terapeútico (Capítulo 1), la regulación epigenética de la expresión génica (Capítulo 2), y el desarrollo de herramientas de ingeniería genética innovadoras para estudios funcionales de genes bacterianos a escala genómica (Capítulo 3). H. influenzae está incluido en la Lista de Patógenos Prioritarios de la Organización Mundial de la Salud para los que el desarrollo de nuevos antimicrobianos se considera una prioridad sanitaria, en este caso debido a su resistencia creciente a ampicilina. Además de la resistencia, la heterorresistencia, tolerancia y persistencia antibiótica contribuyen al fallo terapéutico, y no son detectados mediante procedimientos estandarizados en la práctica clínica. El imipenem es un antibiótico carbapenémico útil en el tratamiento inicial-empírico de infecciones graves debido a su baja toxicidad y baja resistencia. La resistencia de H. influenzae a imipenen es poco frecuente, si bien la evidencia disponible sugiere que los niveles de heterorresistencia están infraestimados. En el Capítulo 1 de este Trabajo, evaluamos la resistencia, heterorresistencia y tolerancia a imipenem en una colección de cepas clínicas de H. influenzae aisladas de muestras respiratorias de pacientes que sufren Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC), y cuyos genomas habían sido previamente secuenciados. Mediante ensayos de tipo difusión en disco, Etest, TD-test y population analysis profiling identificamos un bajo nivel de resistencia, ausencia de tolerancia, y una proporción significativa de heterorresistencia a imipenem. Si bien buscamos rasgos genómicos responsables de la heterorresistencia observada mediante: i) análisis de la variación alélica de los genes ftsI, acrA, acrB y acrR, previamente asociados con heterorresistencia; ii) análisis de variación alélica a nivel genómico entre cepas pertenecientes al mismo tipo clonal pero fenotípicamente heterogéneas; y iii) análisis comparativo de distribución génica a nivel genómico en cepas susceptibles y heterorresistentes, no detectamos asociaciones significativas entre rasgos genéticos concretos y los fenotipos observados. En conjunto, mostramos que la heterorresistencia es un fenómeno con alta prevalencia, complejo y multifactorial, y destacamos la necesidad de implementar protocolos fáciles y rápidos para su identificación en la práctica clínica. Por otra parte, H. influenzae es una bacteria patobionte bien adaptada al ser humano, que provoca infecciones respiratorias en pacientes inmunocomprometidos que sufren, entre otras, EPOC. Los elementos reguladores que dictan la supervivencia y adaptación de H. influenzae en el pulmón de pacientes que sufren EPOC son poco conocidos. En γ-proteobacterias, el estado de metilación de motivos GATC localizados en regiones reguladoras modula la unión de la ARN polimerasa y de factores de transcripción, afectando la transcripción. En los genomas bacterianos, la mayoría de los motivos GATC se encuentran metilados por la metiltransferasa Dam, si bien existen sitios GATC que pueden permanecer no metilados o hemi-metilados si la actividad de Dam se encuentra bloqueada por la unión de proteínas al ADN. La combinación de motivos GATC metilados y hemi- o no metilados en regiones reguladoras o promotoras puede estar asociada a eventos de regulación epigenética de la expresión génica. En el Capítulo 2 de este Trabajo, analizamos la supervivencia de H. influenzae en un modelo pulmonar murino mediante mutagénesis por transposición a escala genómica acoplada a secuenciación profunda (Tn-seq), identificando la contribución de la metiltransferasa Dam en la supervivencia pulmonar de esta bacteria. El estudio del patrón de metilación por Dam a escala genómica mediante secuenciación en tiempo real de moléculas individuales (SMRT-sequencing), mostró motivos GATC no metilados o hemi-metilados en regiones reguladoras, lo que nos llevó a identificar el primer caso de variación fenotípica controlada por metilación Dam en una población de células isogénicas de H. influenzae. Además, la inactivación de dam y el estudio de su efecto a nivel transcriptómico, mediante secuenciación de ARN (RNA-seq) y análisis de expresión génica diferencial, reveló una nueva red regulatoria donde la metilación por Dam y los reguladores transcripcionales FNR y Fur regulan de manera coordinada la expresión de un panel de genes implicados en la defensa anaerobia de H. influenzae frente a especies reactivas de nitrógeno. Estos resultados tienen valor pato-adaptativo en nichos con estrés nitrosativo y baja oxigenación como son las vías respiratorias bajas de pacientes que sufren EPOC. Por último, H. influenzae fue el primer organismo de vida libre cuyo genoma completo fue secuenciado, siendo pionero en el desarrollo y empleo de técnologías -ómicas. Los métodos de secuenciación de inserción de transposones han sido útiles para realizar estudios de función génica e identificar genes esenciales en H. influenzae, si bien en su mayoría los genes que son considerados esenciales tienen funciones desconocidas dada la imposibilidad de generar mutantes. La tecnología de interferencia génica mediante CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat) acoplada a secuenciación profunda (CRISPRi-seq), solventa esta limitación permitiendo el escrutinio y análisis de genes esenciales a escala genómica mediante silenciamiento génico. En el Capítulo 3 de este Trabajo, desarrollamos una plataforma CRISPRi-seq inducible por anhidrotetraciclina para silenciamiento génico programable en H. influenzae a escala genómica, y validamos su utilidad y potencial, abriendo nuevas vías para la comprensión funcional del genoma de esta bacteria. En conjunto, el Trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral supone un avance significativo en el conocimiento de las bases moleculares de la infección por H. influenzae y presenta herramientas de ingeniería genética aplicables a la búsqueda de dianas terapeúticas para el desarrollo de estrategias que mejoren el manejo clínico de infecciones asociadas a este patógeno.

  • English

    This PhD Thesis addresses three key aspects on the study of respiratory infections caused by the opportunistic pathogen Haemophilus influenzae, by focusing on mechanisms different to antibiotic resistance but associated to therapeutic failure (Chapter 1), on the epigenetic regulation of gene expression (Chapter 2), and on the development of innovative genetic engineering tools for genome-wide gene functional studies in H. influenzae (Chapter 3). H. influenzae, due to its increasing resistance to ampicillin, is included in the World Health Organization’s List of Priority Pathogens for which the development of new antimicrobials is a health priority worldwide. In addition to resistance, there are other mechanisms, such as antibiotic heteroresistance, tolerance or persistence, which are underdetected through standardized procedures in the clinical practice but contribute to therapeutic failure. Carbapenem antibiotics, such as imipenem, are useful for initial empirical treatment of severe infections due to their low toxicity and low resistance rates. H. influenzae resistance to imipenem is rare, although available evidence suggests that heteroresistance levels are underestimated. In Chapter 1, we evaluated the resistance, heteroresistance, and tolerance to imipenem in a collection of clinical strains of H. influenzae isolated from respiratory samples of patients suffering Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD), and whose genomes had been previously sequenced. Through disc diffusion, Etest, TD-test and population analysis profiling assays, we identified a low level of resistance, absence of tolerance, and a significant proportion of imipenem heteroresistance. Although we sought genomic traits responsible for the observed heteroresistance through: i) analysis of allelic variation in the ftsI, acrA, acrB, and acrR genes, previously associated with heteroresistance; ii) analysis of allelic variation at the genomic level between strains belonging to the same clonal type but phenotypically heterogeneous; and iii) comparative analysis of gene distribution at the genomic level in susceptible and heteroresistant strains, we did not detect significant links between specific genetic traits and the observed heteroresistance. Overall, we show that heteroresistance is a highly prevalent, complex, and multifactorial phenomenon, highlighting the need to implement easy and rapid protocols for its identification in clinical practice. Furthermore, H. influenzae is a well-adapted bacterial pathobiont in humans, causing respiratory infections in immunocompromised patients, including those suffering COPD. The regulatory elements that dictate the survival and adaptation of H. influenzae in the lungs of COPD patients are poorly understood. In γ-proteobacteria, the methylation status of GATC motifs located in regulatory regions modulates RNA polymerase and transcription factor binding, therefore affecting transcription. In bacterial genomes, most GATC motifs are methylated by the Dam methyltransferase, although some GATC sites can remain unmethylated or hemi-methylated if Dam activity is blocked by proteins binding to the DNA. The combination of methylated and hemi- or non-methylated GATC motifs in regulatory or promoter regions may be indicative of epigenetic regulation of gene expression. In Chapter 2, we analyzed the survival of a panel of H. influenzae mutants in a murine model of lung infection through transposon mutagenesis coupled with deep sequencing (Tn-seq), identifying the contribution of the Dam methyltransferase to H. influenzae lung survival. The study of the genome-wide Dam methylation pattern through single-molecule real-time (SMRT) sequencing revealed unmethylated or hemi-methylated GATC motifs in regulatory regions, leading us to identify the first case of phenotypic variation controlled by Dam methylation in an isogenic population of H. influenzae cells. Moreover, inactivation of the dam gene and the study of its effect at the transcriptomic level through RNA sequencing (RNA-seq) and differential gene expression analysis, revealed a new regulatory network where Dam methylation and the transcriptional regulators FNR and Fur coordinately regulate the expression of a panel of genes involved in H. influenzae anaerobic defense against reactive nitrogen species. These results have patho-adaptive value in niches with nitrosative stress and low oxygenation, such as the lower airways of patients suffering COPD. Lastly, H. influenzae was the first free-living organism to have its complete genome sequenced, pioneering the development and use of -omic technologies. Transposon insertion sequencing methods have been useful in conducting gene function studies and identifying essential genes in H. influenzae, although most of them have unknown functions due to the inability to generate mutants. Bacterial gene interference based on clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat-CRISPR technology coupled to deep sequencing (CRISPRi-seq), overcomes this limitation by allowing the screening and analysis of essential genes at the genomic scale through gene silencing. In Chapter 3, we developed and validated the utility of an anhydrotetracycline-inducible CRISPRi-seq platform for genome-wide programmable gene silencing in H. influenzae, opening new avenues for the functional understanding of its genome. Together, this PhD Thesis work significantly contributes to our understanding of the molecular mechanisms associated to H. influenzae infection, and presents novel bacterial genomic engineering tools applicable to therapeutic target screening in the development of strategies to improve the clinical management of this pathogen.