Resumen de Estudio de infección policlonal, vida extracelular y adaptación metabólica de Haemophilus influenzae en el sistema respiratorio humano
- español
Este trabajo de Tesis Doctoral aborda tres aspectos de la interacción entre la bacteria Haemophilus influenzae no tipificable (HiNT) y el sistema respiratorio humano, considerando el desarrollo de herramientas genéticas de marcaje diferencial y su aplicación al estudio de infecciones policlonales (Capítulo 1), el potencial terapéutico anti-biofilm de moléculas derivadas de cinamaldehído (Capítulo 2), y el papel del triptófano y sus derivados en la modulación de la interacción hospedador-patógeno (Capítulo 3). Los procedimientos clínicos estandarizados para el tratamiento de infecciones bacterianas se basan en la identificación del patógeno causante y la determinación de su susceptibilidad antibiótica, a menudo utilizando bacterias aisladas a partir de una única colonia. En el caso de patógenos respiratorios, esta práctica puede ser cuestionable ya que los pacientes crónicos pueden estar simultáneamente colonizados por clones distintos de un mismo patógeno, con características genotípicas y fenotípicas diferentes que pueden conducir a diferentes perfiles de susceptibilidad antibiótica. Esta heterogeneidad es detectada en aislados de H. influenzae obtenidos a partir de muestras respiratorias de pacientes respiratorios crónicos, cuyos diferentes perfiles de susceptibilidad antibiótica pueden provocar fallo terapéutico en la práctica clínica. En el Capítulo 1 de este Trabajo, generamos una colección de plásmidos modulares que permiten el marcaje diferencial de cepas de H. influenzae. Empleando este marcaje diferencial, estudiamos la formación de biofilm mixtos formados por dos cepas de H. influenzae genéticamente distintas, con diferente capacidad de formación de biofilm y susceptibilidad antibiótica, mostrando la acción selectiva de los antibióticos en estos biofilms policlonales. Además, estudiamos la dinámica de co-infección epitelial por dos cepas de H. influenzae, mostrando la localización intracelular de cepas con distinta capacidad invasiva. Este panel de herramientas abre el camino al estudio de comunidades bacterianas policlonales y polimicrobianas en las que participa H. influenzae. Por otra parte, patologías respiratorias crónicas como la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) facilitan el acceso pulmonar de H. influenzae, que persiste formando biofilms, un estilo de vida protector frente al sistema inmune y tratamientos antibióticos, que cronifica la infección y facilita la aparición de resistencias. H. influenzae está incluido en la Lista de Patógenos Prioritarios de la Organización Mundial de la Salud por su resistencia a ampicilina, resultando prioritario el desarrollo de nuevos antimicrobianos y la estandarización de métodos de evaluación de eficacia de fármacos anti-biofilm. En el Capítulo 2 de este Trabajo, presentamos un panel de protocolos para el análisis sistemático de fármacos anti-biofilm. Como prueba de concepto, evaluamos el efecto antimicrobiano de moléculas derivadas del cinamaldehído frente a cepas de H. influenzae con distinta capacidad de formación de biofilm. Observamos que (E)-Trans-2- nonenal y (E)-3-Decen-2-ona inhiben la formación de biofilms y erradican biofilms preformados por H. influenzae. Además, la baja toxicidad de (E)-Trans-2-nonenal llevó a su selección para encapsulación en nanopartículas poliméricas, que permiten una mayor solubilidad manteniendo el efecto anti-biofilm, y pueden ser útiles para una liberación controlada y segura de fármacos. Por último, H. influenzae dispone de mecanismos pato-adaptativos entre los que se encuentra la evasión de la inmunidad nutricional. El triptófano (Trp) es un metabolito esencial para esta bacteria, que sintetiza su propio Trp y capta Trp exógeno a través de al menos dos sistemas de transporte. Por su parte, el hospedador restringe la disponibilidad de Trp a través de la acción de la enzima indolamina 2,3 dioxigenasa IDO, que cataboliza Trp generando kineurinas que, junto a otros derivados de Trp, son ligandos del receptor de hidrocarburos de arilos AhR. IDO y AhR participan en el control de la respuesta inmune y el mantenimiento de la homeostasis pulmonar. En el Capítulo 3 de este Trabajo, analizamos el efecto de la disponibilidad de Trp exógeno y endógeno en la fisiología e infección respiratoria por H. influenzae. Así mismo, analizamos cómo la disponibilidad de Trp en el sistema respiratorio influye en la interacción hospedador-patógeno, mostrando que el Trp y sus derivados modifican la expresión de IDO, AhR y sus efectores, modulando la respuesta del hospedador frente a la infección por H. influenzae. En conjunto, el Trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral supone un avance significativo en el conocimiento de las bases moleculares de la interacción entre H. influenzae y el sistema respiratorio humano, lo que puede ser de utilidad en el desarrollo de estrategias que mejoren el manejo clínico de enfermedades asociadas a este patógeno.
- English
This PhD Thesis work addresses three aspects of the interaction between the nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) and the human respiratory system, considering the development of genetic tools for differential labelling and their application to the study of polyclonal infections (Chapter 1), the anti-biofilm therapeutic potential of cinnamaldehydederived molecules (Chapter 2), and the role of tryptophan and its derivatives in modulating this host-pathogen interaction (Chapter 3). Standardized clinical procedures for the treatment of bacterial infections are based on pathogen identification and determination of its antibiotic susceptibility, often performed on bacteria isolated from a single colony. In the case of respiratory pathogens, this practice may be questionable since chronic patients can be simultaneously colonized by different strains of the same pathogen, with distinct genotypic and phenotypic characteristics that can lead to different antibiotic susceptibility profiles. This heterogeneity has been detected in H. influenzae isolates obtained from respiratory samples of chronic respiratory patients, whose differential antibiotic susceptibility profiles can lead to therapeutic failure in clinical practice. In Chapter 1 of this work, we generated a collection of module-based plasmids that allow differential labelling of H. influenzae strains. Using this differential labelling, we studied the formation of mixed biofilms by two genetically distinct H. influenzae strains, with different biofilm-forming capacities and antibiotic susceptibility, proving selective antibiotic action in these polyclonal biofilms. Additionally, we studied the dynamics of epithelial co-infection by two H. influenzae strains, revealing the intracellular localization of strains with heterogeneous invasive capacities. This panel of genetic tools paves the way for polyclonal and polymicrobial studies of the different H. influenzae lifestyles. On the other hand, chronic respiratory diseases such as Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) promote the pulmonary access of opportunistic pathogens like H. influenzae, which persist by forming biofilms, a protective lifestyle that contributes to chronicity of infection and facilitates the emergence of antibiotic resistances. H. influenzae is included in the World Health Organization List of Priority Pathogens due to its resistance to ampicillin, making it a priority to both develop new antimicrobials and standardize methods for evaluating the efficacy of anti-biofilm drugs. In Chapter 2 of this work, we present a panel of protocols for systematic analysis of anti-biofilm drug effect, customized to H. influenzae biofilms. As proof of concept, we evaluated the antimicrobial effect of cinnamaldehyde-derived molecules against H. influenzae strains with different biofilmforming capacities. We observed that (E)-Trans-2-nonenal and (E)-3-Decen-2-one inhibit the formation and eradicate pre-formed biofilms by H. influenzae. Additionally, the low toxicity of (E)-Trans-2-nonenal led to its selection for encapsulation in polymeric nanoparticles, which allow for greater solubility, maintain the anti-biofilm effect, and may be useful for the controlled and safe release of drugs. Lastly, H. influenzae has patho-adaptation mechanisms including the evasion of nutritional immunity. Tryptophan (Trp) is an essential metabolite for this bacterium, which is able to synthesize its own Trp and to acquire exogenous Trp through at least two transport systems. On the other hand, the host restricts Trp availability through the action of the enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), which catabolizes Trp generating kynurenines that, along with other Trp derivatives, act as ligands for the aryl hydrocarbon receptor (AhR). IDO and AhR are involved in controlling the immune response and maintaining pulmonary homeostasis. In Chapter 3 of this work, we analyzed the effect of exogenous Trp availability on the physiology of H. influenzae, as well as the importance of Trp synthesis in respiratory infection by this pathogen. Furthermore, we examine how the availability of Trp in the respiratory system influences this host-pathogen interaction, showing that Trp and its derivatives modulate the expression of IDO, AhR, and their effectors, thereby modulating the host's immune response to H. influenzae infection. Altogether, the work carried out during this PhD Thesis represents a significant step forward in the understanding of the molecular basis of the interaction between H. influenzae and the human airways, which may be useful in the development of strategies to improve its clinical management.
