Diseño de circuitos genéticos para la traducción de reacciones químicas en fenotipos seleccionables (Trampas Genéticas), basados en la interacción entre reguladores transcripcionales y sus moléculas efectoras

• Autores: Carlos Álvarez Carreño
• Directores de la Tesis: Víctor de Lorenzo Prieto (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2009
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Berenguer Carlos (presid.), Maria Graciela Pucciarelli (secret.), Josep Casadesús Pursals (voc.), Junkal Garmendia (voc.), Jan Roelof van Der Meer (voc.), Jesús Blázquez Gómez (voc.), Manuel Ferrer Martínez (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
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• Resumen

  • ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS 7 ÍNDICE DE TABLAS 10 ABREVIATURAS 11 SUMMARY 13 INTRODUCCIÓN 15 1. Genotecas Metagenómicas. 17 1.1 Genotecas en fago lambda. 18 1.2 Genotecas en plásmidos, cósmidos y/o fósmidos. 18 1.3 Genotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BACs). 18 2. Análisis de Genotecas Metagenómicas. 19 2.1 Análisis por secuencia para la búsqueda de actividades enzimáticas en genotecas metagenómicas. 20 2.2 Análisis por función para la búsqueda de actividades enzimáticas en genotecas metagenómicas. 22 2.2.1 Tamizado basado en crecimiento condicional. 23 2.2.2 Tamizado basado en el uso de sustratos/productos cromogénicos. 25 2.2.3 Tamizado por SIGEX (Substrate-Induced Gene Expression). 26 3. Trampas Genéticas. 27 3.1 Los reguladores transcripcionales. 30 3.2 Los genes informadores. 31 3.2.1 El gen de la -galactosidasa (lacZ). 31 3.2.2 El gen de la proteína verde fluorescente (gfp). 31 3.2.3 Los genes luxCDABE de bioluminiscencia (lux). 31 3.3 Escherichia coli y Pseudomonas putida como organismos receptores de las trampas genéticas. 32 Índice 2 3.4 Sistemas de inserción de reguladores transcripcionales, promotores y genes informadores en bacterias. 33 3.4.1 Sistema attB/attP de las integrasas de fagos. 33 3.4.2 Minitransposones mini-Tn5 y mini-Tn7. 34 4. La interacción entre moléculas efectoras y reguladores transcripcionales como elementos clave en la construcción de trampas genéticas. 35 4.1 El regulador transcripcional XylR y su interacción con el efector. 35 4.2 Modelo estructural del extremo N-terminal de XylR. 36 4.3 Caracterización de la unión entre XylR y su efector: Entrecruzamiento químico. 38 4.3.1 El bromuro de bencilo como efector funcionalizado. 38 4.3.2 Hipótesis de la reactividad de bromuro de bencilo y con los aminoácidos de XylR. 39 OBJETIVOS 41 MATERIALES Y MÉTODOS 45 1. Cepas y plásmidos. 47 2. Medios y condiciones de cultivo. 51 2.1 Condiciones de inducción con efector en medio líquido. 51 2.2 Condiciones de inducción con efector en medio sólido. 51 3. Manipulación de ácidos nucleicos. 53 3.1 Técnicas generales. 53 3.2 Secuenciación de ADN. 53 3.3 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 53 4. Construcción del plásmido pCAC5 y derivados. 54 5. Manipulaciones genéticas. 56 5.1 Técnicas genéticas en E. coli. 56 5.2 Técnicas genéticas en P. putida. 56 6. Construcción de cepas informadoras de P. putida. 57 7. Inserción de reguladores transcripcionales y promotores en cepas informadoras de P. putida. 57 Índice 3 8. Eliminación de los genes de resistencia a antibióticos en las cepas derivadas de P. putida KT2440. 58 9. Eliminación del extremo derecho del transposón Tn7 en las cepas P. putida KTMoOx-R, P. putida KTDBTR, P. putida KTBx-R, P. putida KTBx5-R, P. putida KTDntRGm, P. putida KT2MoOxLUX, P. putida KT2DBTLUX, P. putida KT2Bx5LUX y P. putida KT2DntRLUX. 60 10. Ensayos de bioluminiscencia de las cepas P. putida para comprobar su capacidad biosensora. 60 10.1 Ensayos en medio líquido. 60 10.2 Ensayos en medio sólido. 61 11. Ensayos de la cepas P. putida para comprobar su capacidad como trampas genéticas. 62 11.1 Movilización de plásmidos como controles positivos y negativos de las trampas genéticas. 62 11.2 Registro de la Bioluminiscencia Específica en medio líquido. 62 11.3 Registro de la bioluminiscencia en medio sólido. 62 12. Cálculo de la eficacia de las trampas genéticas. 62 13. Medición y cálculo de la Bioluminiscencia Específica. 63 14. Ensayos de actividad -galactosidasa en la cepa E. coli CC118 Pu-lacZ. 64 15. Ensayos de registro de Bioluminiscencia Específica en la cepa P. putida KTBx en presencia y ausencia de m-xileno y bromuro de bencilo en función del tiempo. 64 16. Cálculo de la velocidad de producción de Bioluminiscencia Específica de la cepa P. putida KTBx. 64 17. Purificación de la proteína XylR-His. 65 18. Reacción de la proteína XylR-His con bromuro de bencilo. 66 19. Identificación y secuencia de los péptidos marcados. 66 RESULTADOS 69 1. Diseño y construcción de un sistema de dos transposones Tn5/Tn7 para la implantación de trampas genéticas y biosensores en bacterias Gram-negativas. 71 Índice 4 1.1 Construcción de los vectores pTn5LacZ, pTn5Lux y pTn5GFP para la inserción de genes informadores mediante el transposón mini-Tn5. 72 1.2 Construcción del vector pCAC5 para la inserción de reguladores transcripcionales y promotores mediante el transposón mini-Tn7. 72 1.3 Eliminación de los marcadores de presión selectiva. 72 1.4 Activación de la fusión transcripcional promotor/gen informador 73 2. Trampa genética para la identificación de monooxigenasas de anillo. 75 2.1 El regulador transcripcional DmpR. 75 2.2 Construcción de la trampa genética para monooxigenasas de anillo en la cepa P.putida KT2440. 76 2.3 Validación de la cepa P. putida KTMoOx como biosensor de fenol. 77 2.4 Validación de la cepa P. putida KTMoOx como trampa genética para monooxigenasas de anillo. 78 3. Trampa genética para la identificación de actividades de biodesulfurización de dibenzotiofeno. 79 3.1 Los reguladores transcripcionales HbpR y HbpRCBP6. 80 3.2 Construcción de la trampa genética para actividades de biodesulfurización de dibenzotiofeno en la cepa P. putida KT0LUX. 81 3.3 Validación de la cepa P. putida KTDBT como biosensor de 2- hidroxibifenilo. 81 3.4 Validación de la cepa P. putida KTDBT como trampa genética para la identificación de actividades de biodesulfurización de dibenzotiofeno. 81 4. Trampa genética para la identificación de actividades de dehidroclorinación de lindano. 83 4.1 El regulador transcripcional XylR5. 84 4.2 Construcción de una trampa genética para la identificación de actividades de dehidroclorinación de lindano en la cepa de P. putida KT0LUX. 84 4.3 Validación de la cepa P. putida KTBx5 como biosensor de 1,2,4-TCB. 84 4.4 Validación de la cepa P. putida KTBx5 como trampa genética para la identificación de actividades de dehidroclorinación de -HCH. 85 5. Biosensor para la detección de salicilato como intermedio en las rutas de degradación de antraceno y naftaleno. 86 Índice 5 5.1 El regulador transcripcional DntR. 87 5.2 Construcción de un biosensor de salicilato en la cepa P. putida KT0LUX. 87 5.3 Validación de la cepa P. putida KTDntR como biosensor de salicilato. 88 6. Entrecruzamiento químico de la proteína XylR y bromuro de bencilo. 88 6.1 Evidencias in vivo de la interacción entre bromuro de bencilo y la proteína XylR. 88 6.1.1 Ensayos de actividad -galactosidasa con XylR. 89 6.1.2 Ensayos de actividad -galactosidasa con la proteína XylR-His. 91 6.1.3 Ensayos de registro de Bioluminiscencia Específica en la cepa P.

    putida KTBx en presencia y ausencia de m-xileno y bromuro de bencilo. 93 6.2 Evidencia in vitro de la interacción de la proteína XylR-His con bromuro de bencilo. 95 6.2.1 Resultados del análisis de espectrometría de masas de la proteína XylR-His antes y después de la reacción con bromuro de bencilo. 96 6.2.2 Mapeo de los aminoácidos marcados en el modelo del dominio A de XylR. 98 DISCUSIÓN 103 1. Trampas genéticas. 105 1.1 Las genotecas metagenómicas y los hospedadores bacterianos. 105 1.2 El sistema de dos transposones: Eficacia y ortogonalidad. 107 1.3 El sistema de dos tranposones: Dos inserciones frente a una transposición. 107 1.4 Los reguladores transcripcionales, los promotores y los genes informadores. 108 1.5 Las tres trampas genéticas y un biosensor. 108 1.6 Perspectivas futuras. 109 2. Entrecruzamiento químico. 110 2.1 Experimentos in vivo: Actividad -galactosidasa. 111 Índice 6 2.2 Experimentos de cinética de producción de bioluminiscencia. 112 2.3 Experimentos in vitro: XylR-His con bromuro de bencilo. 112 2.4 El modelo del dominio A de XylR y el entrecruzamiento químico. 115 2.5 Perspectivas futuras. 116 CONCLUSIONES 119 BIBLIOGRAFÍA 123 ANEXO 135 Anexo I: Inserción de circuitos genéticos en E. coli. 137 1. Cepas de E. coli. 137 2. Construcción de cepas informadoras de E. coli. 138 3. Inserción de reguladores transcripcionales y promotores en cepas informadoras de E. coli. 138 4. Eliminación del extremo derecho del transposón Tn7 en las cepas E. coli JSBx-LacZ, E. coli XLODmpR-LacZ y E. coli XLBDmpR-LacZ.. 138 Anexo II: Interacción entre bromuro de bencilo y la proteína de fusión MBP-XylR.

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