Análisis estructural de complejos implicados en interacciones con el ADN

• Autores: Javier Coloma Cervera
• Directores de la Tesis: Guillermo Montoya (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2010
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José M. Valpuesta (presid.), José Rodríguez (secret.), Juan Hermoso (voc.), Luis Blanco Dávila (voc.), Carmen San Martín Pastrana (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
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• Resumen

  • La interacción entre las proteínas y el ADN es esencial para distintos procesos celulares. Uno de estos procesos es la replicación del ADN cromosómico donde participan numerosos complejos de proteínas. Uno de ellos es el heterotetrámero GINS que junto a la proteína Cdc45 y el complejo Mcm2-7 forma el CMG, implicado en el desenrrollamiento del ADN. Hemos purificado el complejo GINS humano (hGINS) y hemos mostrado que se une a ADN de cadena sencilla. Usando microscopía electrónica de partículas individuales y reconstrucción 3D obtuvimos una estructura a baja resolución del complejo hGINS, que muestra forma de herradura. La espectrometría de masas y la localización por un anticuerpo monoclonal de una subunidad del tetrámero reveló la organización de las subunidades dentro del complejo hGINS. El análisis detallado del volumen obtenido junto a la comparación con las estructuras atómicas disponibles sugieren la presencia de al menos dos conformaciones del tetrámero. La estructura y el modo de unión a ADN sugieren un posible papel de GINS en el contexto del complejo CMG.

    Las meganucleasas se están convirtiendo en poderosas herramientas para la ingeniería de genomas y terapia génica. Se han modificado la interacción de la meganucleasa I-CreI con el ADN de modo que reconozca secuencias específicas del gen humano RAG1. Se presentan dos estructuras cristalográficas de un mutante heterodimérico de I-CreI con un nuevo diseño de cadena única, scV3-V2(G19S), en el que se han unido dos monómeros en un polipéptido. Este mutante reconoce un fragmento del gen humano RAG1 in vivo e in vitro. Las dos estructuras de scV3-V2(G19S) se han obtenido en presencia de dos cationes distintos: manganeso, que permite que se produzca la reacción de corte del ADN de doble cadena, y calcio, en cuya presencia el gen RAG1 no está cortado.