Resumen de Complexos reguladors amb participació de proteïnes de la família NOD: estudis sobre la interacció entre Citocrom c i Apaf-1 a lapoptosoma.
Noemí Marina García
Lapoptosi o mort cel.lular programada és un procés central al desenvolupament, homeòstasi cel.lular, la resposta a lestrés, lenvelliment i diferents malalties, als organismes eucariotes pluricel.lulars. Una de les vies que regula lactivació de lapoptosi és la via intrinseca mitocondrial, a la que el citocrom c (Cit c), alliberat des de la mitocòndria en reposta a un estímul proapoptòtic, en presència de dATP indueix loligomerizació dApaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) i posterior reclutament de la caspasa-9, conduint a la formació del complex macromolecular activador de lapoptosi anomenat apoptosoma. Citocroms de diferents vertebrats són equivalents en quant a la seva capacitat dinduir apoptosi a sistemes in vitro, mentre que el de llevat (YCit c) no presenta aquesta activitat. En concret sha determinat a partir destudis amb mutants derivats de HHCit c (citocrom c de cor de cavall) i YCit c, que els residus de Lys 7, 25, 39 i 72, així com els residus 62-65 dels citocroms de mamífer participen a la interacció amb Apaf-1. En base a aquests antecedents, i dins de la línia de treball iniciada al nostre laboratori encaminada al descobriment de molècules dinterès terapèutic relacionades amb lapoptosi, es va plantejar com objetiu daquesta tesi lestudi de la interacció entre Cit c i Apaf-1, com un pas preliminar per a lobtenció de compostos orgànics capaços de modular aquesta interacció. En base als antecedents citats, es va proposar la generació de mutants de YCit c que incorporessin modificacions a la seva regió N-terminal que aproximessin la seva seqüència a la de HHCit c, per dotar-los dactivitat apoptòtica, així com pèptids derivats dels mateixos que mantinguessin unit el grup prostètic hemo. Les mutacions plantejades comprenien la delecció de la cua de cinc residus de lextrem N-terminal de la seqüència de YCit c (Delta), i la substitució dels residus Ala 7 i Pro 25 daquest, per dos residus de Lys (A7K, P25K). Addicionalment es va introduir una Met a la possició 27 (K27M), que permetria generar els hemopèptids derivats dels mutants anteriors per degradació química amb BrCN. Per a la realització dels estudis de funcionalitat daquests derivats de YCit c, que comprenien assaigs in vitro dactivació de la caspasa -9 i -3, així com estudis de polarització de la fluorescència, es requeria disposar de la proteïna Apaf-1 en quantitat suficient, pel que es plantejà lobtenció de dues construccions derivades dApaf-1-XL que poguessin expresar-se a E.coli, corresponents als dominis N-terminals CARD- NOD, constitutivament actius, i al C-terminal WDR, responsable de la interacció amb Cit c. Així, es van generar i caracteritzar mitjançant diferents tècniques espectroscòpiques, els mutants derivats de YCit c, YCit c (Delta/A7K/K27M), YCit c (Delta/P25K/K27M) i YCit c (Delta/A7K/P25K/K27M), així com lhemopèptid derivat daquest, HP 7K25K 1-27. Igualment es van obtenir construccions derivades dApaf-1-XL que comprenien els residus 1-570 i 1-572, corresponents als dominis N-terminals, així com les que comprenien els residus 570-1248 i 583-1248, corresponents al domini C-terminal. Els estudis dactivació de caspases en cap cas van posar de manifest una capacitat proapoptòtica dels mutants generats. El mateix resultat negatiu es va obtenir per a lhemopèptid anterior i pèptids sintètics derivats de la seqüència de HHCit c, sintetitzats al laboratori del grup col.laborador del Dr. E. Pérez- Payá (Centro de investigación Príncipe Felipe, València). No obstant, els estudis de polarització de la fluorescència van posar de manifest la capacitat del mutant YCit c (Delta/A7K/P25K/K27M) dinteraccionar amb Apaf-1. El conjunt daquests resultats indicava que les mutacions introduïdes a la seqüència de YCit c eren suficients per induir en aquest la capacitat per interaccionar amb Apaf-1, però no suficients per induir la formació de lapoptosoma actiu. Per a lhemopèptid es va determinar una potencial capacitat inhibidora de la formació de lapoptosoma, que quedava emmascarada per lefecte oxidatiu del grup prostètic hemo. Aquests mateixos assaigs van permetre establir la funcionalitat per a totes les proteïnes recombinants derivades dApaf-1-XL. Amb motiu duna estada al laboratori del Profesor G. Núñez (University of Michigan, Ann Arbor, EUA) es plantejà un objetiu addicional que va consistir en la determinació dels components del complex de reconeixement del component bacterià muramil dipèptid (MDP), responsable de lactivació de la resposta inflamatòria mediada per Nod2, proteïna de la família NOD, a la que pertany igualment Apaf-1. Així, assaigs dimmunoprecipitació amb derivats del MDP, van indicar una interacció no directa entre aquest i Nod2. Mitjançant cromatografia dafinitat i posterior anàlisi per espectrometria de masses shan determinat potencials components del complex de reconeixement del MDP. Addicionalment, estudis preliminars de localizació cel.lular del MDP ha indicat que aquest seria incorporat per les cèl.lules de macròfag per la via endocítica.
