Estratègies analítiques per a la detecció d'hormones anabolitzants basades en l'ús de receptors específics
- Autores: Juan Pablo Salvador Vico
- Directores de la Tesis: Francisco Sánchez Baeza (dir. tes.), Ana María Grandas Sagarra (dir. tes.), María Pilar Marco (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2008
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Enrique Pedroso Muller (presid.), Mercè Granados Juan (secret.), Rosa Ventura Alemany (voc.), Henny Hooghuis de Korver (voc.), Antonio Abad-Fuentes (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
Els esteroides anabolitzants androgènics (AAS) són compostos sintètics que mimetitzen lefecte que produeix la testosterona, androgen endogen. Aquest tipus de compostos sutilitzen per laugment del rendiment físic dels esportistes o per incrementar la producció de carn en làmbit de la ramaderia. Aquest tipus de pràctiques estan regulades i prohibides per diferents organismes tant governamentals com esportius, la qualcosa crea una necessitat de disposar de mètodes de control. Com a resposta a aquesta situació, el propòsit daquesta tesi doctoral ha estat el desenvolupament de noves metodologies basades en receptors selectius per a la determinació de diferents AAS en matrius biològiques. Es descriuen el desenvolupament i laplicació de diferents tècniques immunoquímiques (ELISA i Immunosorbents) per la determinació de Estanozolol (St), Boldenona (B) i Metilboldenona (MB) en orina bovina. Així com es desenvolupa un ELISA per la determinació de la Tetrahidrogestrinona, THG, un nou anabolitzant de disseny que va ser sintetitzat per no ser detectat. També es descriu el desenvolupament dun nou tipus de receptors sintètics, els MIPs (Molecular Imprinted Polymers), selectius per Testosterona i Boldenona.
Per tal dobtenir anticossos policlonals selectius pel St, B, MB i THG, shan dissenyat lhaptèns dimmunització fent servir deines de modelització molecular per avaluar el grau de homologia entre aquests hatens, els analits diana i els corresponents metabòlits. Així, els 5 haptens dissenyats i sintetitzats haurien de permetre el reconeixement de A) St i 3OHSt (hB_St), simultaneament; B) St i 16?OH-St (hA_St), simultaneament; C) B, MB i alfa-B (hA_B), simultaneament; D) MB (hB_MB) i E) THG (hTHG). Per la immunització, cadascun dels haptens preparats es va acoblar covalentment a lHCH (horseshoe crab hemocyanin). La producción danticossos es va fer mitjançant protocols ben establerts al laboratori amb conills blancs de la varietat New Zealand.
La determinació immunoquímica de molecules de baix pes molecular es fa sota configuracións de tipus competitu, per la qualcosa va ser necessari preparar altres inmunoreactius, per acobalment covalent dhaptens amb la BSA (bovine serum albumin) i a lHRP (horseradish peroxidase). Daquesta manera es van establir els següents assaigs immunoenzimàtics per a la detecció de St, B, MB i THG.
. Pel cas del St, es van obtenir 3 diferents ELISAs per a la determinació selectiva de St, St i 3OH-St, i St i 16?OH-St, amb una detectabilitat de IC50 de 0.55, 2.15 i 1.65 nM, respectivament pel St.
Per la B i MB, es van obtenir unes corbes de calibració en format directe amb una IC50 de 4 nM i 2.15 nM.
Per la determinació de THG es va obtenir una IC50 de 1.44 nM.
Per tal de detectar-les en matrius tan de origen animal com dorigen humà, es van desenvolupar diferents procediments analitics.
Finalment, un altre tipus de metodologia desenvolupada per la determinació de hormones anabolitzants és la de utilitzar polímers dempremta molecular (MIP) per la testosterona. Aquesta metodologia consisteix en fer polimeritzar la testosterona en presència duns monòmers de reconeixement i amb lajut dun agent reticulant, per crear una xarxa tridimensional que conté la testosterona. Un cop eliminada de la matriu polimèrica la testosterona es quedaria una cavitat que té afinitat per la testosterona. Aquesta metodologia es va realitzar amb èxit pel reconeixement específic de la testosterona.
" SUMMARY:
The Anabolic Androgenic Steroids (AAS) are family of compunds that mimic the endogen androgenic hormone, the testosterone. These compounds are illegally used to improve the performance in athletes and also as a growth promoter in cattle. Theses practices are banned by the corresponding organizations like WADA and EC, which has raised the need to develop analytical methods of control. In this context, the aim of this thesis has been the development of new methodologies based in selective receptors for the determination of AAS in different matrices. With this purpose, different immunochemical techniques (ELISA and Immunosorbent) for the detection key AAS such as Stanozolol (St), Boldenone (B) and Methylboldenone (MB), and their corresponding metabolites, have been established. Similarly, the immunochemical detection of Tetrahydrogestrinone (THG), the new designer steroid known asthe clean has also been addressed. Moreover, artificial receptors, such as molecular imprinted polymers (MIPs )for the selective recognition of testosterone and boldenone have also been developed and evaluated.
The detectability achieved for the ELISAs developed is suffucient to perform analysis in real samples in compliance with the EC and WADA regulations. The IC50 values of each ELISA method are summarized as follow:
St: Three assays with different detectability, IC50= 0.55, 2.15 and 1.65 nM, with a different pattern of cross-reactivity, depending which metabolite could be detected.
B/MB: Two different assays specific for B, IC50= 4nM, and for MB, IC50= 2.15 nM.
THG: A specific assay was developed with an IC50 of 1.44 nM.
Regarding MIPs a selective artificial receptor for the determination of T and B is reported. "
