Caracterización bioquímica y estructural de TrwK, un motor molecular implicado en la secreción bacteriana

• Autores: Alejandro Peña Ontalvilla
• Directores de la Tesis: Ignacio Arechaga Iturregui (dir. tes.), Fernando de la Cruz (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Cantabria ( España ) en 2013
• Idioma: español
• Número de páginas: 143
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jaime Martín-Benito Romero (presid.), Matxalen Llosa Blas (secret.), Dirk Roeland Boer (voc.)
• Materias:
  • Ciencias agrarias
    • Fitopatología
      • Bacterias
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: UCrea
• Resumen

  • Los sistemas de secreción Tipo IV (SST4) participan en la transferencia conjugativa de ADN y proteínas desde las células donadoras hacia las células diana. Para llevar a cabo dicha transferencia, es necesaria la producción de energía. Existen tres ATPasas hexaméricas en la membrana interna de la célula, pertenecientes al SST4, las cuales proporcionan la energía para el proceso global de la transferencia conjugativa. TrwK es una de esas ATPasas. Está codificada por el plásmido conjugativo R388 y es un miembro de la familia VirB4 podría ser una ATPasa que participa en la dinamización y ensamblaje del pilus conjugativo. Por ello, los objetivos de esta tesis son: 1. Caracterización bioquímica y funcional de TrwK 2. Estudio de los mecanismos de regulación de la actividad de TrwK 3. Estudio comparativo a nivel estructural, bioquímico y filogenético de TrwK y TrwB para establecer posibles relaciones evolutivas entre TrwK y translocadores de ADN 4. Resolución de la arquitectura estructural de TrwK mediante microscopía electrónica. Hemos demostrado que TrwK es capaz de hidrolizar ATP in vitro en ausencia de sus potenciales sustratos y otros componentes del SST4 mediante estudios cinéticos y de conjugación de su forma salvaje y un mutante para el motivo Walker B. (Arechaga, I 2008). Mediante estas dos técnicas, se estudiarán también otras construcciones con interés bioquímico y/o estructural correspondientes a su estreno C-terminal definiendo esta región como auto-inhibitoria de la proteína (Peña 2011). Se ha obtenido la primera estructura de la proteína entera en su forma hexamérica activa mediante microscopía electrónica (Peña 2012). Mediante estudios filogenéticos del �domino motor� de TrwK, el cual contiene los sitios de unión a nucleótidos, se ha mejorado las relaciones filogenéticas anteriores (Iyer 2004) acotándolas solo a su región más conservada entre la familia delas ATPasas RecA, situando a TrwK estrechamente relacionada con translocasas de ADN asociadas a membrana como TrwB y FtsK. Además, el ajuste de las estructuras cristalográficas de dichas proteínas en el volumen obtenido mediante microscopía electrónica de TrwK, refuerza aún más dicha relación filogenética y estructural. Atendiendo a estas similitudes, se han llevado a cabo ensayos de unión a ADN de TrwK. Sorprendentemente, TrwK es capaz de unir ADN con estructura G-cuadruplex con mayor afinidad que ADN de cadena sencilla, esta característica fue descrita anteriormente en TrwB (Matilla 2010). Ensayos de interacción y de actividad ATPasa reflejan que ambas proteínas son capaces de interaccionar formando heterocomplejos no funcionales, pudiendo tener relevancia biológica en el proceso de la transferencia del ADN, durante la conjugación bacteriana, actuando como mecnismo �interruptor� (Peña 2012). Conclusiones: 1. TrwK presenta actividad ATPasa. 2. El estado oligomérico de TrwK es dependiente de las condiciones de sales, pH y concentración. 3. Las estructuras alfa-helicoidales presentes en el extremo C-terminal de TrwK están implicadas en la auto-inhibición de la proteína. 4. TrwK es capaz de unir ADN, presentando, al igual que TrwB, una mayor afinidad por estructuras G-quadruplex que por cadena sencilla. 5. Obtención de la primera estructura tridimensional de TrwK en su estado hexamérico. 6. El ajuste de las estructuras cristalográficas de translocasas de ADN en el volumen de TrwK, junto con la capacidad de unión al ADN, refuerza la hipótesis de que las VirB4 están filogenéticamente relacionadas con dichas ATPasas de la familia RecA, compartiendo con ellas un dominio motor altamente conservado.