Desarrollo de terapias específicas de mutación en enfermedades metabólicas hereditarias
- Autores: Patricia Yuste Checa
- Directores de la Tesis: María Belén Pérez González (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Fernández Piqueras (presid.), Pedro Bonay Miarons (secret.), Aurora Martínez Ruiz (voc.), Karen J. Heath (voc.), Juan Aymami Bofarull (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
La caracterización funcional específica de mutaciones causantes de enfermedad guía el desarrollo de estrategias terapéuticas. En este trabajo hemos analizado funcionalmente mutaciones que afectan al proceso de splicing y mutaciones missense con el fin de desarrollar terapias específicas dirigidas a rescatar transcritos aberrantes y mutaciones desestabilizadoras.
En primer lugar, mediante el análisis del perfil transcripcional de células derivadas de pacientes hemos caracterizado una mutación exónica y otra intrónica interna que afectan ambas al proceso de splicing. La mutación exónica (c.75C>T), detectada en el gen ALDH7A1, genera un nuevo sitio donador de splicing provocando la deleción de 35pb del exón 1 causando epilepsia dependiente de piridoxina (PDE). La mutación intrónica interna (c.792+182G>A), identificada en el gen TMEM165 activa la inserción de un pseudoexón de 117pb procedentes del intrón 4 causando el defecto congénito de glicosilación TMEM165-CDG. El efecto de estas dos mutaciones sobre el proceso de splicing ha sido confirmado mediante el uso de un sistema ex vivo de minigenes. Por otra parte, con el fin de caracterizar funcionalmente mutaciones missense identificadas en pacientes con CDG causado por deficiencia de la enzima PMM2 (PMM2-CDG), hemos estudiado el perfil de oligomerización, la actividad y la estabilidad de estos mutantes en un sistema de expresión procariota. Los resultados in vitro combinados con análisis in silico mediante el algoritmo computacional FoldX y la localización de los residuos en un modelo estructural de la proteína PMM2, nos ha permitido la clasificación de los nueve mutantes estudiados en tres categorías: mutaciones que afectan al plegamiento (p.V44A, p.D65Y, p.R162W, p.T237M, p.F207S y p.C241S), que retienen cierta actividad residual, mutaciones que afectan al plegamiento y a las propiedades catalíticas de la proteína (p.R123Q y p.R141H), las cuales tienen actividad nula, y una mutación que afecta a la dimerización de PMM2 (p.P113L). Además, ha sido posible la recuperación de la actividad de algunos de los mutantes inestables en un modelo celular de enfermedad en condiciones permisivas de plegamiento. Todos estos resultados sugieren que la pérdida de función de la mayoría de los mutantes estudiados está basada en su inestabilidad y por lo tanto en su tendencia a agregar o a ser degradados, mecanismo subyacente en las denominadas enfermedades conformacionales.
Basándonos en estos resultados, el siguiente paso ha sido la búsqueda de terapias dirigidas a rescatar los defectos de splicing y los mutantes inestables caracterizados previamente. Respecto a las mutaciones de splicing, hemos conseguido una recuperación del perfil transcripcional y de la proteína correctamente localizada de manera específica de secuencia y de dosis, tras el tratamiento con oligonucleótidos antisentido que modulan el splicing de células de pacientes PDE y TMEM165-CDG homocigotos para las mutaciones c.75C>T y c.792+182G>A respectivamente. El éxito de la terapia antisentido aplicada sobre una mutación exónica, constituye una prueba de concepto que amplía su posible uso más allá de las mutaciones intrónicas internas. Respecto a la terapia de recuperación de mutantes inestables, el rastreo de una librería comercial de compuestos nos ha permitido identificar quince potenciales chaperonas farmacológicas (PCs) que estabilizan la proteína PMM2. Estos compuestos han sido evaluados posteriormente en un sistema de expresión procariota y algunos de ellos han sido capaces de aumentar significativamente la actividad de la proteína WT y la estabilidad, tanto de la PMM2 WT como de los mutantes de plegamiento. Además, cuatro compuestos han conseguido rescatar la actividad de dos mutantes inestables, p.R162W y p.T237M, en un modelo celular de enfermedad. Al mismo tiempo, hemos identificado un regulador de la proteostasis (PR), celastrol, que también ha sido capaz de incrementar la actividad de mutantes inestables de PMM2 en el mismo modelo celular. Así, el celastrol podría ser aplicado conjuntamente con PCs con el fin de aumentar de manera sinérgica la estabilidad de los mutantes y por tanto su actividad. Estos resultados constituyen una prueba de concepto sobre el posible uso de fármacos estabilizadores que recuperen la actividad de PMM2 y establece las bases para el desarrollo de una nueva terapia para PMM2-CDG, el CDG más común y actualmente sin tratamiento.
En resumen, el éxito de las aproximaciones terapéuticas descrito en este trabajo para PDE, TMEM165-CDG y PMM2-CDG, abre nuevas perspectivas para el tratamiento de enfermedades raras al demostrar la eficacia de terapias basadas en el mecanismo de acción de las mutaciones.
