Resumen de Análisis global de la expresión de gens de lenguado (Solea senegalensis) y de ratón (Mus musculus) mediante genotecas substractivas, microchips de DNA y qRT-PCR
El presente trabajo se ha centrado en dos especies animales de gran importancia en el ámbito alimentario, sanitario y biomédico. Así, el lenguado senegalés (Solea senegalensis) es un organismo no modelo de gran interés para la acuicultura por sus grandes expectativas de mercado, pero cuyo cultivo se ve dificultado por diversas patologías y su sensibilidad a diferentes situaciones de estrés. Por ello, en esta especie se ha analizado la expresión transcripcional en respuesta a 2 mg/kg de CuSO4 (compuesto zoosanitario) o 25 mg/kg de LPS (mimético de infecciones bacterianas). Por otra parte, el ratón de laboratorio (Mus musculus) es la especie modelo más utilizada en investigación debido a su gran similitud fisiológica y genética con el hombre. En M. musculus, se han realizado estudios de expresión transcripcional, tanto in vivo como in vitro, en respuesta a estrés oxidativo por la relación de este tipo de estrés con numerosos procesos fisiopatológicos incluido el cáncer.
La obtención de los patrones de expresión diferencial y su análisis funcional se ha abordado desde un punto de vista multidisciplinar, recurriendo a diversas aproximaciones experimentales y metodológicas, como genotecas substractivas, microchips de DNA, qRT-PCR en tiempo real y silenciamiento de la expresión génica mediante interferencia por RNA (RNAi).
La obtención de genotecas substrativas en S. senegalensis permitió la identificación de genes diferencialmente expresados en respuesta a CuSO4. Adicionalmente, mediante esta técnica, se obtuvo la secuencia parcial de 229 clones, lo que supone un avance considerable en el conocimiento genómico (de acceso público) del lenguado senegalés. El microchip desarrollado para la platija europea, P. flesus (plataforma GENIPOL) resultó una herramienta muy útil para analizar la expresión transcripcional de S. senegalensis. Se estudió la respuesta hepática de lenguados expuestos durante 6 y 24 horas a CuSO4 o LPS. El análisis funcional de los resultados permitió identificar genes de respuesta específica a CuSO4, a LPS, o a ambos tratamientos. Asimismo, aunque este microchip se construyó con ESTs procedentes de hígado de platija, resultó válido para analizar la respuesta transcripcional del riñón cefálico en el lenguado, discriminando entre genes que codifican transcritos con patrones específicos de expresión hepática o renal.
El análisis global de la expresión transcripcional en hígado de ratón en respuesta a paraquat (2 horas, 30 mg/kg, aprox. la mitad de la LD50) se efectuó empleando una plataforma comercial de microchips (Agilent) donde está representado el genoma completo del ratón. El análisis funcional de los resultados muestra genes relacionados fundamentalmente con la respuesta a estrés, el metabolismo de xenobióticos, el crecimiento y muerte celular, y el metabolismo de lípidos. Asimismo, la detección de genes de función desconocida (e.g. Arrdc3) constituye un punto de partida en el estudio de las funciones de las proteínas que codifican.
El efecto del silenciamiento del gen Prdx1 sobre la expresión transcripcional global se analizó en células de hepatocarcinoma de ratón Hepa 1-6 expuestas a 30 µM de CdCl2 durante 2 horas. En las condiciones estudiadas, Prdx1 desempeña un papel más relevante como reguladora de la actividad celular que como proteína antioxidante, ya que los genes diferencialmente expresados se relacionaron principalmente con la presentación de antígenos, la señalización celular, y el crecimiento, proliferación y muerte celular. Prdx1 parece actuar como un oncogén, de manera que la inhibición de su expresión podría traducirse en la inducción de apoptosis.
Se seleccionaron un total de 18 transcritos de lenguado y 17 de ratón en función de la relevancia fisiológica de sus productos y de la magnitud y especificidad de su respuesta para su cuantificación absoluta por RT-PCR en tiempo real, confirmándose, en general, los resultados obtenidos con las genotecas substractivas y con los microchips de DNA. Como cabía esperar, la cuantificación por qRT-PCR en tiempo real resultó ser una metodología más sensible ya que, en la mayoría de los casos, los cambios de expresión detectados con esta técnica fueron superiores a los obtenidos con los microchips. Asimismo se confirmó la importancia de la cuantificación absoluta de los transcritos frente a la relativa, que tiende a sobredimensionar las variaciones de los transcritos menos abundantes. La cuantificación absoluta de los transcritos seleccionados no se limitó a las muestras empleadas en al análisis global, sino que se amplió a muestras procedentes de diferentes individuos, órganos, tratamientos y tiempos de exposición, proporcionando nueva información acerca de los perfiles de expresión de los genes analizados y de su variabilidad interindividual.
