Resumen de Influence of soil properties on the toxicity of metal-polluted soils. Comparison of different bioassay methods
ENGLISH VERSION Soil is an essential part of the ecosystem that acts as a sink of contamination since it has a high buffer capacity compared with other ecosystem compartments like water and air. When contaminants end up in soil, they can be stored, transformed, or transferred to other media. The presence of contaminants in soils needs a proper environmental assessment to prevent pollution or to determine measures to cope with contaminated soils. Several millions of hectares of land all over the globe are polluted with a wide variety of contaminants, being metals and metalloids among the substances that generate major problems due to they do not degrade and can accumulate in the environment. Although metal emissions have decreased in the European Union over the last few years, the production of new hazards involving metals has increased. This especially concerns the widely deployed production of materials involving metal-based nanoparticles, exhibiting chemical and biological properties that are quite different from those of the corresponding bulk materials.
In the problems concerning environmental contamination, soil properties are the main factors that control the mobility, (bio) availability and toxicity of metals in terrestrial ecosystems. However, guideline values to declare a soil as polluted are currently based on laboratory studies without taking into account key factors such as soil properties or long-term equilibration processes (ageing), which could change the fate and bioavailability of metals.
The aim of this thesis was to study the fate and ecotoxicological effects of metals (Pb, Zn and Cu) and metalloids (As) as well as metal-based nanoparticles in soils (ZnO NP). This included determining the influence of soil properties and also the effects of ageing (long-term equilibration) on the (bio)availability and toxicity of these elements. For this purpose, four bioassays representing the major groups of soil organisms were applied, following standard test guidelines: i) Seed germination/ Root elongation Toxicity Test (U.S. EPA 850:4200) with the plant Lactuca sativa; ii) Microtox®Test (ASTM, 2004) with the bacterium Vibrio fischeri; iii) Soil Respiration Test (ISO 17155, 2002) with soil microorganisms; and iv) Earthworm Survival and Reproduction Test (OECD 207 and 222) with Eisenia andrei. These tests were performed both in laboratory-spiked soils with different properties and in soils affected by residual contamination (Aznalcóllar mine spill, Spain). The main goal of this thesis was to improve the scientific basis for the environmental risk assessment of metals and metalloids in soils, with the following specific objectives: - to study the influence of ageing on metal bioavailability and toxicity in soils, - to assess the effect of soil properties on metal availability and toxicity, - to evaluate the use of bioassays to define guideline values, - to relate the data obtained in soils spiked in laboratory with soils polluted in situ, - and, to implement the obtained results in a framework of risk assessment.
In chapter 2 we compared the effect of Zn applied as ZnO nanoparticles (ZnO NPs) and as Zn2+ ion (ZnCl2) on the earthworm Eisenia andrei at different periods after spiking three natural soils with different soil properties. The results showed lower Zn availability in soils when applied as ZnO NP compared to the Zn ion form. Zn availability was different according to the soil type, indicating the high influence of soil properties in the behavior of this element, and highlighting the pH as a main property controlling the potential toxicity of Zn. Internal zinc concentration in earthworms (ZnE) was highest for the soil with high organic carbon content and basic pH spiked with ZnO NP, indicating the key role of soil type in the availability and toxicity of this element. Further scientific research and ecotoxicological testing of compounds with nanoparticles must be performed to support reliable environmental risk assessment for legislative purposes.
The study of ageing and equilibration of contaminated soil over time may provide a more realistic insight into metal behaviour and its potential toxicity under natural conditions. In chapter 2, it was shown that Zn availability from ZnO NPs or ionic Zn was differently influenced by ageing depending on the soil type. Although ageing did not show clear effects on Zn toxicity in this study, knowledge on the importance of long-term processes for Zn availability is crucial for a proper risk assessment of ZnO NPs as well as Zn-polluted soils. Long-term effects and the availability of metals and metalloids in field-contaminated soils were determined 6 and 15 years after the mining spill in an area affected by residual pollution (Aznalcóllar mine) in chapter 7. In this case, under natural conditions, soil pH tended to increase with time and concentrations of pollutants in soil tended to decrease. Poorly recovered areas were still present 15 years after the spill, indicated by the absence of vegetation and high pollutant concentrations. This study showed that there are possible ecological threats in the studied area, so more detailed ecological risk assessment or intervention actions are needed.
A battery of toxicity tests using a number of representative species belonging to different taxonomic groups is needed to obtain proper insight into the potential hazard of a chemical for the ecosystem. In this thesis different toxicity tests were performed to assess the toxicity of individual metals, while different bioassays were used to determine toxicity of field-contaminated soils (chapters 2-6; chapter 8). Our findings show that the response of the different tests to the same metal greatly differed. Results indicated that earthworm reproduction and lettuce root elongation tests were more sensitive to metal pollution and gave more uniform toxicity values with smaller confidence intervals. Therefore, for identifying actual soil toxicity, different organisms will give different results, so the use of a battery of tests is essential for performing a more complete and reliable assessment of the toxicity of metals and/or contaminated soils. The number of tests and organisms should be optimized depending on the circumstances and required level of detail of the information needed.
In order to determine the effect of soil properties on metal pollution, seven different representative soils were spiked with different elements individually (As, Pb, Zn and Cu). Soils were incubated for 4 weeks to take into account the effect of time on metal availability. Soil properties effects were studied in all chapters of this thesis. Our findings highlight that soil properties have a critical influence on metal (bio)availability and they have to be included in the ecological risk assessment of contaminated soils as well as in the setting of soil quality criteria for metals. The broad range of responses in the test soils in relation to soil properties can lead to over- or under-protective guideline values, which will also influence the efficacy of remediation goals and actions. Consequently, soil guideline values must be differentiated depending on soil properties, in order to optimize their efficiency and profitability in environmental risk assessment.
The guideline values derived in chapters 3-6 were compared with the current legislation as well as with effects observed in natural soils polluted with a range of elements (Aznalcóllar spill). The results (chapter 8) showed that the existing guideline values in Andalusia (Decree 18/2015) (where the Aznalcóllar soils are located) are not sufficiently accurate to declare contaminated soils and therefore the risk of pollution could be over- or underestimated depending on the considered element. The large differences in values obtained are due to the high diversity of soil types. Therefore a new approach taking into account soil properties to determine limits to soil toxicity is essential for a proper Ecological Risk Assessment. Current regulation should be revised in order to apply these findings to develop more efficient and effective policy regulation.
¿ RESUMEN CASTELLANO El suelo es una parte esencial del ecosistema que actúa como sumidero para la contaminación, debido a su gran capacidad amortiguadora en comparación con los otros dos grandes compartimentos de los ecosistemas: el agua y el aire. Cuando algún tipo de elemento potencialmente contaminante llega al sistema suelo, éste puede ser almacenado, transformado o transferido dentro de los ciclos del agua o aire, así como a la cadena trófica. Por lo tanto, la presencia de sustancias contaminantes en los suelos necesita de una evaluación ambiental adecuada para evitar la dispersión de la contaminación o para decidir qué medidas se deben tomar a la hora de realizar actuaciones de recuperación. En todo el mundo se ha constatado la existencia de millones de hectáreas de suelos contaminados, estando los metales y metaloides entre las sustancias que generan mayores problemas debido a que se trata de elementos que no se degradan y se acumulan en el medioambiente. Aunque a lo largo de los últimos años, las emisiones de metales han disminuido en la Unión Europea, la producción de nuevas sustancias compuestas por metales ha aumentado drásticamente. En concreto, se han desarrollado un amplio número de productos de uso diario con componentes de nanopartículas con base metálica, los cuales poseen propiedades químicas y biológicas muy diferentes a las formas metálicas más tradicionales.
Dentro de la problemática de la contaminación ambiental, las propiedades del suelo son los principales factores que controlan la movilidad, (bio) disponibilidad y toxicidad de los metales en los ecosistemas terrestres. Sin embargo, los niveles de referencia orientativos para declarar un suelo como contaminado se basan actualmente en estudios realizados en laboratorio, sin tener en cuenta muchos de los factores clave como son el efecto de las propiedades del suelo o los procesos de equilibrio que se producen a largo plazo (envejecimiento). Estos factores podrían cambiar el comportamiento y por lo tanto la biodisponibilidad de los metales en los suelos y deben ser estudiados en profundidad.
A la vista de lo expuesto anteriormente, la finalidad de esta tesis fue estudiar el comportamiento y los efectos ecotoxicológicos de los metales (concretamente: Pb, Zn y Cu) y metaloides (As), así como las emergentes formas metálicas a tamaño nanopartícula (en concreto fue estudiado la tercera forma más abundante en la actualidad: ZnO NP) en los suelos. Para ello se estudió la influencia de las propiedades del suelo así como los efectos del envejecimiento (equilibrio de los metales en suelo a largo plazo) en la (bio) disponibilidad y toxicidad de estos elementos. Estos estudios se desarrollaron a partir de cuatro bioensayos con representación de los principales grupos de organismos del suelo, siguiendo directrices establecidas en pruebas estándar: i) estudio del efecto tóxico en la germinación de semillas y en la elongación de raíz de la planta Lactuca sativa (US EPA 850: 4200); ii) efecto de la toxicidad en la reducción de la luminiscencia de la bacteria marina Vibrio fischeri a partir de un test realizado con un Microtox® (ASTM, 2004); iii) estudio de la respiración heterotrófica de los organismos de suelo (ISO 17155, 2002); y iv) estudio de la supervivencia, reproducción y bioacumulación de la lombriz de tierra Eisenia andrei (OECD 207 y 222).
Los estudios desarrollados en esta tesis se han realizado tanto en suelos con distintas propiedades contaminados artificialmente en laboratorio, así como en los suelos afectados por el vertido minero de 1998 de la mina de Aznalcóllar (España). El objetivo principal de esta tesis pretende mejorar la base científica para la evaluación del riesgo ambiental de los metales y metaloides en suelos, a partir de los siguientes objetivos específicos: - estudiar la influencia del envejecimiento sobre la biodisponibilidad y toxicidad de metales en los suelos, - evaluar el efecto de las propiedades del suelo en la disponibilidad de los metales y en la toxicidad que producen, - evaluar el uso de bioensayos como herramientas para definir niveles genéricos de referencia para la contaminación, - relacionar los datos obtenidos en suelos contaminados artificialmente en el laboratorio con suelos contaminados in situ, - y por último, poner en práctica los resultados obtenidos dentro del marco de evaluación del riesgo ecológico (ERE).
En el capítulo 2 de esta tesis se comparó el efecto de Zn aplicado como nanopartículas (ZnO NP) y como forma iónica (ZnCl2) sobre la lombriz de tierra Eisenia andrei después de diferentes periodos de incubación del suelo en tres suelos con propiedades contrastantes. Los resultados mostraron una menor disponibilidad de Zn en suelos cuando fueron contaminados con ZnO NP en comparación con la forma de iónica. La disponibilidad de Zn varió según el suelo estudiado, lo que claramente destacó la importancia de las propiedades del suelo en el comportamiento de este elemento, remarcando al pH como una propiedad fundamental en el control de la toxicidad potencial de Zn. La concentración interna de zinc en las lombrices de tierra (ZnE) fue más alta para el suelo con alto contenido en carbono orgánico y pH básico contaminado con Zn aplicado en forma de nanopartícula, lo cual refuerza la idea de que no sólo la disponibilidad del elemento afecta a la biodisponibilidad y toxicidad sino también el tipo de suelo. A la vista de nuestros resultados es indiscutible que se deben realizar más pruebas ecotoxicológicas para los compuestos con nanopartículas para fortalecer la evaluación del riesgo ambiental dentro de la legislación existente y tratar los compuestos que las contengan de forma distinta a las formas metálicas comunes.
El estudio del equilibrio de un suelo contaminado con el tiempo (envejecimiento) puede proporcionar una visión más realista del comportamiento de metal y su toxicidad potencial en condiciones naturales. En el capítulo 2, también se observó que la disponibilidad de Zn tanto en suelos contaminados con ZnO NPs o con ZnCl2, estuvo influenciada por el proceso de envejecimiento con diferentes resultados dependiendo del tipo de suelo. Aunque el envejecimiento no mostró efectos claros sobre la toxicidad de Zn en este estudio, el conocimiento de los procesos que rigen a largo plazo la disponibilidad de este elemento es clave para una evaluación adecuada del riesgo de suelos contaminados por Zn en cualquiera de las dos formas estudiadas. Además, los efectos a largo plazo y la disponibilidad de metales y metaloides en suelos contaminados in situ se determinaron 6 y 15 años después del accidente minero de Aznalcóllar en el capítulo 7. En este caso, bajo condiciones naturales, en general el pH del suelo tendió a aumentar con el tiempo y las concentraciones de contaminantes en el suelo tendieron a disminuir. Sin embargo después de 15 años de que se produjera el accidente y se realizaran actividades de recuperación, siguen existiendo áreas mal recuperadas que a simple vista presentan ausencia de vegetación y una vez analizadas mostraron tener altas concentraciones de metales. Este estudio demostró que aún existen posibles amenazas ecológicas en la zona y que son necesarias acciones para la evaluación de riesgos e intervenciones de recuperación de los suelos.
Para obtener una visión adecuada del peligro potencial de una sustancia química para el ecosistema es necesario realizar una batería de ensayos de toxicidad utilizando un número de especies representativas de los distintos grupos taxonómicos (bioensayos). En esta tesis se realizaron diferentes pruebas para evaluar la toxicidad de metales de forma individual en suelos contaminados en laboratorio (capítulos 2-6), así como se evaluó la toxicidad por multi-elementos en suelos contaminados de la zona de Aznalcóllar (capítulo 8). Los resultados obtenidos mostraron que las respuestas obtenidas para los diferentes bioensayos difirieron ampliamente para un mismo metal. En concreto las pruebas de elongación de raíz para lechugas (L. sativa) y las de reproducción para lombrices (E. andrei) fueron los test más sensibles a la contaminación por metales y dieron valores de toxicidad más uniformes con intervalos de confianza más pequeños. Por lo tanto, para una evaluación más completa y fiable de la toxicidad de metales o de la contaminación de suelos se deben emplear más de un único bioensayo. El número de pruebas y organismos a estudiar debe ser optimizado en función de las circunstancias y el nivel de detalle requerido según la información que se persigue alcanzar con dichas pruebas.
Con el fin de determinar el efecto de las propiedades del suelo sobre la contaminación por metales, siete suelos con propiedades representativas de los principales grupos de suelos fueron contaminados con formas metálicas de forma individual (As, Pb, Zn y Cu). Además los suelos se incubaron durante 4 semanas para evaluar el efecto del tiempo sobre la disponibilidad de metal. Los efectos de las propiedades del suelo fueron estudiados en todos los capítulos de esta tesis. Nuestros resultados pusieron de relieve que las propiedades del suelo fueron claves en la (bio)disponibilidad y tienen que ser incluidos en la evaluación del riesgo ecológico de suelos contaminados, así como en el establecimiento de criterios de calidad del suelo para la contaminación por metales. La amplia gama de respuestas que se obtuvo en nuestros suelos expone claramente que no tener en cuenta las propiedades edáficas puede llevar a sobreestimar o subestimar la toxicidad y por lo tanto, invalidar los valores de referencia establecidos generalmente a partir de valores únicos, lo que influirá en la eficacia de los objetivos y acciones de remediación. En consecuencia, los niveles de referencia del suelo deben diferenciarse en función de las propiedades del suelo, con el fin de optimizar la eficiencia y rentabilidad en la evaluación del riesgo ambiental.
Los datos obtenidos de los bioensayos en los capítulos 3-6 se compararon con la legislación vigente, así como con los efectos observados en los suelos naturales contaminados de Aznalcóllar. Los resultados obtenidos (capítulo 8) mostraron que los valores de referencia existentes en Andalucía (Decreto 18/2015) (donde se encuentra localizada nuestra zona de estudio) no son suficientemente precisos para declarar un suelo como contaminado y por lo tanto el riesgo de contaminación podría estar sobrestimado o subestimado en función del elemento considerado. Las grandes diferencias en los valores obtenidos se deben a la gran diversidad de tipos de suelo. Por lo tanto, y a la vista de todo lo expuesto, un nuevo enfoque teniendo en cuenta las propiedades del suelo es esencial para una adecuada evaluación de riesgos ecológicos, concretamente por contaminación metálica en suelos. Por lo tanto, la regulación actual debe ser revisada con el fin de aplicar los resultados obtenidos en esta tesis para desarrollar una legislación realmente eficiente y útil.
