Química de la interacción sexual en los hongos mucorales phycomyces blakesleeanus y blakeslea trispora
- Autores: José Antonio González Delgado
- Directores de la Tesis: Alejandro Fernández Barrero (dir. tes.), Jesús Fernández Arteaga (codir. tes.), María del Mar Herrador del Pino (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carlos Jiménez (presid.), José Francisco Quílez del Moral (secret.), José Fernando Reyes Benítez (voc.), Thomas Ostenfeld Larsen (voc.), Esther del Olmo Fernández (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
El ß-caroteno es un pigmento natural con propiedades antioxidantes, provitamínica A y colorante muy apreciado por las industrias farmacéutica, agroalimentaria y cosmética. Se obtiene comercialmente tanto por síntesis química como por biotecnología. Aunque esta última es minoritaria, está en auge favorecida por el rechazo creciente de los aditivos químicos en la alimentación y las preferencias de la farmacología y la cosmética. Siendo entonces los hongos particularmente atractivos como fuentes de ß-caroteno, en concreto los hongos Mucorales, de los que destacan Blakeslea trispora y Phycomyces blakesleeanus.
Blakeslee, en 1904, dividió las estirpes de Mucorales en dos tipos sexuales denominados (+) y (¿). Los dos tipos son indistinguibles morfológicamente y sólo se pueden identificar debido a su reacción en presencia del otro sexo. Estirpes silvestres de Phycomyces blakesleeanus en cultivos mixtos del sexo (+) y (¿) incrementan el contenido en ß-caroteno comenzando así su desarrollo morfológico durante el ciclo sexual. Estos efectos fisiológicos se atribuyen a una serie de compuestos llamados trisporoides. Algunos trisporoides dan excelentes actividades biológicas, siendo la más interesante su capacidad para inducir la formación de zigóforos, primer paso en el proceso sexual en Mucorales. Esto origina, a su vez, un considerable aumento de la producción de ß-caroteno (carotenogénesis) en estos hongos, lo que le confiere a los trisporoides un gran interés industrial. La producción de ß-caroteno se observa por una intensificación de la coloración rojo-anaranjada en la zona sexual cuando dos micelios de diferente sexo se encuentran próximos. Actualmente, todas las evidencias experimentales indican que son las feromonas encargadas de estos procesos sexuales.
Dado el interés de este tipo de compuestos, el análisis exhaustivo de los mismos en estos hongos ha sido objeto de estudio en esta Tesis Doctoral.
En este análisis se han aislado e identificado 12 apocarotenoides en cultivos mixtos de las estirpes F986 (+) y F921 (¿) de Blakeslea trispora, 9 de ellos son nuevos productos naturales. Cinco de los nuevos apocarotenoides tienen 7 carbonos (C7) y constituyen una nueva familia de apocarotenos, y otro de ellos presenta una estructura heterocíclica que constituye un nuevo esqueleto trisporoide. Entre todos los metabolitos encontrados, existen apocarotenoides C18, C15, C7 y un C13 en muy pequeña cantidad. La existencia de los tres primeros grupos de compuestos en cantidades casi equimoleculares nos ha permitido postular un nueva ruta biosintética que implica una primera etapa de ruptura asimétrica de ß-caroteno a través de los dobles enlaces ¿13,14 y ¿11¿,12¿. La separación de los compuestos se ha efectuado mediante HPLC semipreparativa en fase normal y la identificación mediante técnicas espectroscópicas, fundamentalmente de RMN. También se ha llevado a cabo con buenos rendimientos la síntesis química de los apocarotenoides C7 y C13 que ha permitido confirmar su estructura y obtenerlos en cantidades suficientes para su posterior evaluación biológica.
En el caso de Phycomyces blakesleeanus se han aislado e identificado 11 apocarotenoides en los cultivos mixtos de las estirpes silvestres NRRL1555 (¿) y A56 (+), junto con la identificación de dos apocarotenoides mediante el uso de patrones. De ellos, cinco son nuevos productos naturales y seis se identifican por primera vez en Phycomyces. Dos de los nuevos apocarotenoides son C7 y se han aislados también en Blakeslea, y otro de los nuevos apocarotenoides presenta una estructura heterocíclica que constituye un nuevo esqueleto trisporoide. Entre todos los metabolitos encontrados, existen apocarotenoides C18, C15 y C7 en cantidades casi equimoleculares lo que nos ha permitido como en el caso de Blakeslea, postular una nueva ruta biosintética mediante doble ruptura oxidativa de ß-caroteno. La separación de los compuestos y su identificación se ha efectuado como en Blakeslea. La estructura de los cinco apocarotenoides nuevos se ha confirmado por síntesis química.
En cultivos individuales de estas estirpes de Phycomyces se han aislado e identificado C7 y C15 apocarotenoides, también identificados en el cultivo mixto. La cantidad de apocarotenoides en cultivos individuales es unas siete veces menor que en cultivos mixtos. Se han efectuado propuestas biosintéticas para algunos apocarotenoides C15 nuevos.
Se ha llevado a cabo por primera vez la síntesis total y enantioselectiva de (+)-apotrisporina E y (+)-apotrientrioles A y B (nuevos apocarotenoides aislados de cultivos mixtos e individuales de Phycomyces). La metodología usada implica una ciclación biomimética utilizando Cp2TiCl ó ZrCl4 para originar el anillo ciclohexénico convenientemente funcionalizado y una posterior olefinación de Horner-Wadsworth-Emmons para incorporar la cadena lateral. Con estas síntesis, se pudieron confirmar las estructuras de los apotrientrioles A y B, y establecer la configuración S en C¿2, además de obtener los productos en cantidades suficientes para futuras pruebas de actividad biológica.
Finalmente, se ha puesto a punto un método analítico mediante HPLC-MS-DAD para la identificación rápida y eficaz de apocarotenoides en cultivos, tanto individuales como mixtos, de Phycomyces blakesleeanus. Mediante esta técnica se ha establecido la presencia de nuevos apocarotenoides nunca antes descritos en cultivos de este hongo. Análisis a los dos días de incubación indican que ya se han originado la mayoría de los apocarotenoides presentes en el hongo incluyendo algunos precursores que se transforman posteriormente. En un estudio comparativo entre cultivos a dos y cinco días, se observan diferencias cuali- y cuantitativas entre la distribución de apocarotenoides observándose una mayor proporción de metabolitos con un alto grado de oxidación y la desaparición de algunos formados inicialmente.
