Síntesis de inhibidores de histonas desacetilasas con actividad antitumoral

• Autores: Sonia Panadero Fajardo
• Directores de la Tesis: José Antonio Gómez Vidal (dir. tes.), José Francisco Domínguez Seglar (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2011
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: M Díaz Gavilán (presid.), Mavys Tabraue Chávez (secret.), Nuria de Pedro Montejo (voc.), Asier Unciti Broceta (voc.), Ana Isabel Sáez Castillo (voc.)
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  • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
• Resumen

  • Antecedentes EL genoma humano se localiza dentro del núcleo celular en la cromatina, que es un complejo macromolecular dinámico formado por nucleosomas. Un único nucleosoma se compone de un fragmento de ADN enrollado alrededor de un octámero de histona. Las histonas son pequeñas proteínas básicas ricas en los aminoácidos lisina y arginina. Los cuatro tipos de histonas nucleosómicas contienen dos dominios: el dominio C-terminal y el dominio N-terminal. La acetilación de residuos de lisina en las secuencias N-terminales está mediada por las enzimas denominadas histonas acetiltrasferasa (HAT). Los grupos acetilo son eliminados de las N-acetil-lisinas por la actividad de las histonas desacetilasas (HDAC). El balance entre las actividades opuestas de las HAT y HDAC regula el estado de acetilación de las histonas. En general, altos niveles de acetilación (hiperacetilación) se asocian a un incremento de la actividad transcripcional, mientras que bajos niveles de acetilación (hipoacetilación) se asocian a la represión de la expresión genética. Actualmente se conocen diversos tipos de inhibidores de las HDAC que pueden reactivar la expresión genética e inhibir el crecimiento de las células tumorales, por lo que se investiga su uso en el tratamiento frente al cáncer. Por otro lado, también se ha descrito la implicación de las enzimas HDAC en la expresión génica de ciertos parásitos, jugando un papel importante en la lucha contra determinadas enfermedades parasitarias, tal como la leishmaniosis. Nuestra investigación se centrará en torno a estas dos enfermedades.

    Objetivos Objetivo 1. Síntesis, purificación y caracterización de nuevos inhibidores de las HDAC.

    a) Optimización de la reacción de Suzuki-Miyaura para los derivados de la 1,1-dióxido-3-oxo-2H-benzo[d]isotiazol.

    b) Optimización de la reacción de Sonogashira para los derivados de la 1,1-dióxido-3-oxo-2H-benzo[d]isotiazol.

    c) Optimización de la reacción de Heck para los derivados de la 1,1-dióxido-3-oxo-2H-benzo[d]isotiazol.

    d) Optimización de la reacción de cicloadición de Huisgen o reacción Click para los derivados de la 1,1-dióxido-3-oxo-2H-benzo[d]isotiazol.

    Objetivo 2. Evaluación de la actividad antiproliferativa sobre diferentes líneas tumorales de los productos finales sintetizados.

    Objetivo 3. Evaluación de la actividad antiparasitaria frente a la especie Leishmania infantum de los productos finales sintetizados.

    Objetivo 4. Establecimiento de las relaciones estructura-actividad para fármacos HDACi derivados del heterociclo 1,1-dióxido-3-oxo-2H-benzo[d]isotiazol, que permita orientar el diseño y la síntesis de nuevos inhibidores más potentes.

    Discusión y resultados La familia de enzimas de las HDAC viene siendo una de las dianas para el diseño de nuevos fármacos más estudiada en los últimos años. La estructura del sitio activo enzimático de las HDAC permite la obtención de nuevos inhibidores mediante modificación de pseudotipos previamente descritos, en los que se establecen tres zonas estructurales susceptibles de mejora desde el punto de vista de la Química Farmacéutica: a) un grupo voluminoso, con afinidad hacia la zona situada al comienzo del canal hidrofóbico, b) un espaciador, que ha de presentar un longitud adecuada, y c) un grupo quelante del Zn2+ situado en el sitio catalítico propiamente dicho. El diseño y la síntesis de nuevos inhibidores de las HDAC objeto de esta Memoria se ha basado en la estructura del compuesto MTC-124, previamente sintetizado por la Dra. Mavys Tabraue Chávez como parte de su Tesis Doctoral, dentro de nuestro Grupo de Investigación. Este inhibidor demostró tener actividad biológica como antiproliferativo. Debido a la experiencia adquirida durante la Tesis Doctoral previa, la investigación desarrollada se ha centrado en las modificaciones sobre la cabeza lipófila, manteniendo en la estructura general el fragmento de ácido hidroxámico como quelante del Zn2+ catalítico, y el espaciador lineal de naturaleza lipófila.

    Las modificaciones estructurales realizadas se basan en la introducción de diferentes grupos en el fragmento correspondiente a la cabeza lipófila, el heterociclo 1,1-dióxido-3-oxo-2H-benzo[d]isotiazol, comúnmente conocido como sacarina. Las sustituciones se han realizado (en su mayoría) de forma correlativa en la posición 5 y 6 del anillo heterocíclico. Para ello, la estrategia sintética elegida llevó a la obtención de los derivados de sacarina sustituidos con bromo en las posiciones 5 y 6 [(5/6)-bromo-1,1-dióxido-3-oxo-2H-benzo[d]isotiazol], que se usaron como material de partida para las sucesivas modificaciones estructurales. Dichas modificaciones se realizaron tras la optimización de las reacciones químicas de acoplamiento cruzado de Suzuki-Miyaura, de Sonogashira y de Heck-Mizoroki, además de la reacción de cicloadición de Huisgen o click. En la mayoría de los casos, la reactividad propia del heterociclo de sacarina obligó a la correcta elección de las condiciones básicas necesarias para un rendimiento aceptable y una pureza adecuada del producto final.

    Se han sintetizado 43 productos finales, los cuales se han dividido en dos grupos en función de la evaluación biológica realizada. De estos, 20 productos tienen interés como fármacos antitumorales y 23 tienen interés como fármacos antiparasitarios. Todos ellos se han clasificado a su vez en subgrupos en función de sus características estructurales.

    Evaluación biológica Estudios de la actividad antiparasitaria La evaluación antiparasitaria de los compuestos se ha llevado a cabo por el Grupo de Investigación BIO-176 del Departamento de Parasitología en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Granada, bajo la supervisión de la Profesora Joaquina Martín Sánchez. Entre los resultados obtenidos cabe destacar que el compuesto SPF-841 mostró actividad frente a Leishmania infantum con una CE50 = 3.71 µM, superior a la encontrada para el vorinostat (CE50 = 6.26 µM). Además, el derivado 112 también dio lugar a una actividad antileishmania con una CE50 = 3.21 µM. Igualmente es importante resaltar que los efectos tóxicos observados sobre los macrófagos a altas dosis (50 µM) del vorinostat, no se encuentran en el caso del derivado 112. Estos compuestos son objeto de una solicitud de patente por parte de la Universidad de Granada.

    Estudios de la actividad antitumoral La evaluación de la actividad antitumoral de los compuestos sintetizados se ha realizado en colaboración con dos centros de investigación independientes. El Nodo de Coordinación del Banco de Tumores de Andalucía ha llevado a cabo la evaluación sobre las líneas celulares humanas SF-260 (ganglioma), H-460 (carcinoma pulmonar de células grandes) y MCF7 (adenocarcinoma de glándula mamaria). Junto a estas líneas se ha incluido un estudio con una línea mínimamente pasada para determinar si los fármacos de este tipo presentan diferencias de actividad sobre cultivos de células más próximos a la realidad clínica.

    El Centro de Excelencia en Investigación de Medicamentos Innovadores en Andalucía (Fundación MEDINA) ha realizado la evaluación de los fármacos obtenidos sobre las líneas celulares humanas MCF7, A-549 (adenocarcinoma pulmonar de células epiteliales), HT-29 (adenocarcinoma de colon), HL60 (leucemia promielocítica), RCC4 (carcinoma de células renales, con vector y mutadas para VHL) y HepG2 (carcinoma de células hepáticas). También se han incluido las líneas no transformadas humanas Fa2N-4 (procedente de células hepáticas) y CCD-16 Lu (fibroblastos pulmonares).

    La evaluación de la capacidad antiproliferativa de los compuestos descritos se llevó a cabo mediante el test de MTT. Este test se utiliza para determinar la citotoxicidad de aquellos fármacos que inhiben la viabilidad celular y el crecimiento. Las células vivas metabolizan el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio obteniéndose formazan, cuya concentración se puede determinar en función de la absorbancia a 570 nm. Dicha concentración es proporcional al número de células vivas. Este estudio está basado en el sistema de metabolización de la succinato-tetrazolin reductasa, enzima perteneciente a la cadena respiratoria mitocondrial, que solo está activa en células metabólicamente intactas.

    De la librería de compuestos obtenida, el compuesto SPF-729 fue el inhibidor que presentó una mayor actividad antitumoral frente a diferentes líneas tumorales ensayadas, en muchos casos con una potencia superior a la del fármaco control vorinostat.

    El fármaco SPF-553 dio lugar a una inhibición del crecimiento tumoral en una línea mínimamente pasada de origen pulmonar resistente a tratamiento.