Resumen de Studies regarding the influence of some yeast strains on the volatile compounds and biogenic amines content of white wines
RESUMEN Palabras clave: Aligoté, Muscat Ottonel, SBSE-GC-MS, PCA, MVA.
1. Introducción El proceso de fermentación alcohólica de los mostos de uva constituye un paso decisivo en el proceso de elaboración del vino, formándose la mayoría de los componentes del vino a lo largo de este proceso. Las levaduras son los agentes que se usan para llevar a cabo la fermentación alcohólica y son los principales contribuyentes a la calidad sensorial y analítica del vino.
Durante mucho tiempo, la fermentación alcohólica se llevó a cabo por las levaduras indígenas que están naturalmente presentes en la piel de la uva, el material de la bodega y el medio de fermentación. Últimamente, se ha generalizado el uso de cultivos iniciadores de levaduras seleccionadas tanto en el área de cultivo de la vid donde se ha cosechado la uva como en otras zonas vitivinícolas, siendo comercializadas de diversas formas. El uso de estas levaduras seleccionadas permite mejorar la eficiencia de la fermentación alcohólica, evitando procesos de atascamiento o enlentecidos, y produciendo mejores vinos de calidad.
El aroma del vino es el resultado de la contribución de unos pocos cientos de compuestos volátiles que se clasifican desde el punto de vista enológico de acuerdo a su diferente origen en varietales, pre-fermentativas, fermentativos y, aquellos formados como consecuencia del proceso de envejecimiento. También se sabe que la elaboración de vinos jóvenes de alta calidad con características expresivas y distintivas varietales es una tendencia muy actual y estable entre los consumidores de vino, y que los productores de vino quieren satisfacer.
Algunos compuestos, que muestran valores bajos de concentración en los vinos, pueden tener efectos indeseables en la salud del consumidor. Entre estos compuestos se han de mencionar las aminas biogénicas que en altas concentraciones son tóxicas, siendo responsables de ciertos trastornos del sistema nervioso central (tales como la depresión y la esquizofrenia), trastornos del sistema cardiovascular y digestivo. Aunque inicialmente las aminas biogénicas se consideraron sustancias "naturales" en los alimentos, hoy en día se sabe que su origen puede estar asociado con los procesos de deterioro causado por microorganismos debido a que se pueden formar a través de la descarboxilación de aminoácidos por ciertas bacterias y levaduras.
Por estas razones, el conocimiento de la influencia de las levaduras en los parámetros de calidad clave de vinos es necesario.
Este estudio se centra en la fermentación alcohólica, comparando los vinos obtenidos a partir de una fermentación espontánea con la microbiota indígena (utilizada como control) y los vinos obtenidos mediante cultivos iniciadores de siete cepas de levaduras comerciales ampliamente utilizadas por productores de vino en Rumania y otros países de Europa, y además, una cepa de levadura seleccionada en el área de cultivo de la vid Iaşi por la Estación de Investigación de Viticultura y Enología de Iaşi. Todos los vinos obtenidos a través de la fermentación de los mostos de uva de las variedades Aligoté y Muscat Ottonel, cultivadas en la zona Iaşi, con las levaduras antes mencionados, se analizan en términos de parámetros físico- químicos y también en términos de compuestos aromáticos y contenidos aminas biogénicas, con el objeto de establecer el efecto de las cepas de levadura en la composición y calidad de Aligoté y Muscat Ottonel vinos.
2. Contenido y conclusiones de la investigación La tesis se estructura en dos partes, "Estado del conocimiento" y "Contribuciones propias"; está compuesta por siete capítulos con un total de 219 páginas, 35 tablas, 42 figuras y fotografías en color, 223 referencias y 26 archivos adjuntos. La primera parte del documento se refiere a la situación actual del conocimiento sobre el tema tratado, incluyendo la introducción y tres capítulos, y en la segunda parte se presenta la propia investigación estructurada en tres capítulos seguidos de conclusiones y referencias.
Capítulo I, titulado Estado actual de la investigación en relación con los compuestos volátiles en vinos, ofrece información actualizada sobre los aspectos generales de los principales compuestos volátiles de los vinos, sus características, así como la forma en que se ven influenciados por las levaduras.
Capítulo II, titulado Estado actual de la investigación relativa a las aminas biógenas de vinos, se compone de tres subcapítulos que se refieren a la formación de aminas biógenas en los alimentos, su catabolismo y su presencia en el vino.
El capítulo III, titulado Estado actual de la investigación sobre los métodos analíticos utilizados para determinar los compuestos volátiles y aminas biógenas en vinos, presenta datos generales y específicos referentes a los análisis de compuestos volátiles y aminas biogénicas análisis, los métodos de extracción de compuestos de aroma de vino, así como el equipo utilizado.
La parte de la propia investigación comienza con el capítulo IV en el que se presenta el contexto organizativo e institucional en el que el proyecto de la tesis doctoral se llevó a cabo.
El capítulo V subraya los principales objetivos de la investigación y los más modernos protocolos de métodos de análisis reconocidos por la OIV. También se describen las variedades de uva estudiadas, el medio ambiente natural de los viñedos de Iasi y Montilla-Moriles y la forma de obtener las variantes experimentales.
El capítulo VI presenta los resultados de los análisis y una discusión sobre ellos.
La tesis doctoral termina con las conclusiones generales (capítulo VII) que sintetizan las principales aportaciones de la tesis y las implicaciones de los resultados obtenidos como la influencia de algunas cepas de levadura en el contenido de compuestos volátiles y aminas biógenas de los vinos estudiados.
El objetivo principal de nuestro estudio es evaluar la influencia de algunas cepas de levaduras seleccionadas sobre la composición de los vinos Aligoté y Muscat Ottonel de las viñas de Iasi.
Los principales objetivos de nuestro estudio fueron los siguientes: • Análisis de compuestos volátiles de las uva y mostos estudiados.
• Desarrollo de un método para diferenciar los perfiles aromáticos de la uvas y mostos por quimiometría.
• Establecer la influencia de las cepas de levadura en los principales parámetros físico- químicos de los vinos Aligoté y Muscat Ottonel.
• Establecer la influencia de las cepas de levadura en la composición de compuestos volátiles en vinos Aligoté y Muscat Ottonel.
• Establecer la influencia de las cepas de levadura en la composición de aminas biógenas en vinos Aligoté y Muscat Ottonel.
• Establecer la influencia de las cepas de levadura en la composición de los compuestos fenólicos en los vinos Aligoté y Muscat Ottonel.
• Análisis de los parámetros cromáticos de los vinos, la simulación por ordenador de sus colores y el cálculo de las diferencias de color (E).
• Interpretación estadística de los resultados obtenidos.
La diferenciación de los mostos por su perfil aromático se realizó mediante el uso de dos variedades de uva desde la viña de Iasi, Rumania (Aligoté y Muscat Ottonel) y dos variedades de uva de la región de Montilla-Moriles, España (Muscat de Alejandría y Pedro Ximénez). Las uvas fueron cosechadas en madurez tecnológica óptima en condiciones sanitarias, y se congelaron a - 18 °C hasta su prensado. Después de descongelar en un refrigerador a 4 °C, las uvas se prensaron con una prensa de acero inoxidable de laboratorio (Ferrari, Italia), sin aplastar las semillas. El mosto de uva obtenido se homogeneizó, se centrifugó durante 5 minutos a 5000 rpm, e inmediatamente se sometió a la determinación de pH, acidez total y el azúcar. Para el análisis de compuestos volátiles, varias fracciones de 100 ml se congelaron a -18 °C en recipientes estériles.
Los compuestos volátiles libres y los que fueron liberados después de la hidrólisis ácida se analizaron con un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas, después de ser extraída en una barra de agitación magnética, seguida de una desorción en una unidad de desorción térmica (TDU).
Para estudiar la influencia de las cepas de levaduras sobre el contenido de compuestos volátiles y aminas biógenas en el vino, se utilizaron dos variedades de uva blanca (Aligoté y Muscat Ottonel) del viñedo de Iasi, cosecha 2013. Cuando llegaron a la madurez tecnológica, las uvas fueron cosechadas en cajas de plástico y después de la recepción cuantitativa y cualitativa, las uvas fueron desgranadas, aplastadas, y prensadas inmediatamente con una prensa hidráulica.
El mosto obtenido se homogeneizó y se dividió en nueve partes iguales; ocho de estos lotes fueron inoculados con cultivos puros de cepas de levaduras seleccionadas de la siguiente manera: el lote 1 (A1 para los vinos Aligoté respectivamente M1 para los vinos Muscat Ottonel) fue inoculado con la cepa de levadura comercial vendida con el nombre de Fermol Aromatic®, el lote 2 (A2 , M2) fue inoculado con la cepa de levadura comercial Saccharomyces cerevisiae vendida con el nombre de Cross Evolution®, el lote 3 (A3, M3) con ZYMAFLORE X16®, A4 y M4 con Fermol Cryoarome®, A5 y M5 con Fermactive Thyol®, A6 y M6 con Fermactive AP®, A7 y M7 con Fermactive Muscat®, A8 y M8 con la cepa de levadura A2B seleccionada por la Estación de Investigación de Viticultura y Enología, de Iasi. El noveno lote se dejó para la fermentación espontánea y se utilizó como control. Tras el fin de la fermentación alcohólica, los vinos se esterilizaron por filtración, se sulfataron, embotellaron y depositaron en la bodega.
Después de seis meses, se analizaron las muestras de vino con el fin de evaluar los parámetros físico-químicos y el contenido de compuestos volátiles y aminas biogénicas. El principales análisis físico-químico y de aminas biogénicas se realizaron en el Laboratorio de Enología de la Facultad de Horticultura de USAMV Iasi, mientras que los compuestos volátiles y los análisis cromáticos se realizaron en el laboratorio del Grupo Vitenol, Universidad de Córdoba, España.
Los vinos así obtenidos fueron caracterizados según su contenido alcohólico, acidez total y volátil, sustancias reductoras, extracto total seco, extracto no reductor, valores de pH, densidad, SO2 libre y total, por medio de análisis físico-químicos.
Los principales compuestos volátiles de los vinos se determinaron mediante inyección directa en un cromatógrafo de gases con detector FID; los compuestos volátiles minoritarios se determinaron mediante la técnica SBSE-TD-GC-MS; los compuestos fenólicos, mediante el uso de métodos de espectrofotometría, el color, utilizando el método CIE Lab, mientras que las aminas biogénicas se determinaron mediante el uso de métodos de cromatografía de líquidos.
Con el fin de obtener los vinos, empezamos desde la materia prima homogénea, las uvas siendo todas de la misma parcela y el mosto procedente del estrujamiento de las uvas se homogeneizó y luego se dividió en partes iguales con el fin de inocular con las cepas de levaduras seleccionadas.
Tomando en consideración que el proceso tecnológico aplicado era el mismo para todas las condiciones experimentales, las diferencias obtenidas entre los compuestos analizados se deben principalmente a las cepas de levadura ensayadas en la elaboración del vino.
Para los vinos Aligoté, el contenido de alcohol oscila entre levaduras estudiadas en un 1,15% v/v entre 11,11 y 12,26% v/v; todos los vinos pueden ser considerados como vinos de tipo seco, con excepción de los vinos de control que se obtuvieron con la microbiota indígena, que también mostró el contenido más alto de acidez volátil. Parece que el uso de cepas de levadura seleccionadas llevó a una reducción de la acidez total de 5,48 g tartárico/L (A7) y el aumento del valor de pH a 3,73 (A6) en comparación con el vino de control que ha registrado una acidez de 6,21 g/L y pH 3,09. Además, en nuestras condiciones experimentales, los vinos Aligoté producidos con las levaduras Cruz Evolution (A2), Fermactive AP (A6), Fermactive Muscat (A7), y A2B (A8) obtuvieron un contenido de extracto no reductor inferior a 17 g/L, lo que no permite enmarcar el vino en la categoría de vino DOC.
A excepción de la muestra de control, todos los vinos Muscat Ottonel obtenidos fueron vinos secos, con un contenido alcohólico que varían entre 12,89 y 14,14% v/v, dependiendo de la cepa de levadura utilizada. La diferencia de 1,25% v/v de alcohol se debe especialmente a la cepa de levadura, que utiliza diferente cantidad de azúcar para producir 1% v/v de alcohol.
Además, una pequeña parte de la diferencia puede ser debida a las pérdidas que se producen durante la fermentación turbulenta, cuando una pequeña cantidad de alcohol es liberada por dióxido de carbono. Los vinos más extractivos se obtuvieron mediante el uso de la Fermactive Muscat, Fermactive AP y cepas de levadura ZYMAFLORE X16, con un extracto no reductor que varía entre 20 y 22 g/L.
En cuanto a los compuestos volátiles, se han identificado 51 compuestos en el mosto de uva de las cuatro variedades estudiadas, de los cuales 14 fueron clasificados como terpenos y norisoprenoides, siete como aldehídos y cetonas, dos como alcoholes, siete como compuestos de benceno, ocho como ácidos orgánicos y 13 como ésteres. De los 51 compuestos volátiles identificados, tres fueron descritos por primera vez en el mosto de uva.
Teniendo en cuenta la superficie relativa de todos los compuestos volátiles individuales incluidos en los seis grupos establecidos y utilizando análisis estadísticos avanzados (análisis de variables múltiples y de componentes principales) se realizó una diferenciación objetiva entre los mostos de diferentes variedades de uva.
En el caso de los vinos Muscat Ottonel estudiados, 65 compuestos aromáticos fueron identificados por análisis de GC-FID y SBSE-TD-GC-MS, de los cuales 35 fueron cuantificados de manera absoluta y 30 se cuantificaron de manera estimada, en función de su superficie relativa, que es directamente proporcional a su concentración. Se observó que las diferencias en la composición de compuestos volátiles es más cuantitativa que cualitativa.
Con el fin de evaluar la influencia de los compuestos aromáticos cuantificados al aroma global del vino, hemos calculado el valor de actividad de olor (OAV) para cada compuesto.
Además, cada compuesto se atribuyó a una o más series odorantes, dependiendo de sus descriptores de aroma, de acuerdo con la literatura. Para este estudio, se utilizaron las siguientes series: floral, afrutada, verde, dulce, graso y químicas.
Para los vinos Muscat Ottonel, el butanoato de etilo, hexanoato de etilo, heptanoato de etilo, acetato, octanoato decanoato de etilo, linalol, nerol, ácido octanoico, succinato de dietilo, alcohol isoamílico, (forma levo) E-2-hexenol y 2,3-butanodiol fueron los compuestos del aroma más característicos con un OAV por encima de la unidad en la mayoría de los casos.
Se observó que todos los vinos Muscat Ottonel estudiados se caracterizaron por el olor a fruta, registrando estas series odorantes los valores más altos (entre 37,32 para M1 y 48,51 para M6) y estando formados por cuatro terpenos, ocho ésteres y dos polioles.
En el caso de los vinos Aligoté, se han identificado 64 compuestos volátiles categorizadas en los mismos seis grupos químicos que en los vinos Muscat Ottonel. Los compuestos que caracterizan a la mayoría de nuestras muestras Aligoté, con OAV por encima de la unidad en la mayor parte de la variante experimental, fueron: acetato de isoamilo, butanoato de etilo, hexanoato de etilo, heptanoato de etilo, decanoato de etilo, succinato de dietilo, linalol, nerol, geraniol, 2,3 -butanediol (levo), alcohol isoamílico, E-2-hexenol y ácido butanoico. Además, en la muestra control, valores de OAV por encima de la unidad se registraron para el lactato isobutanol y acetato.
La serie odorante "afrutado" registró los valores más altos en todas las variantes experimentales, excepto la variante A4 donde la serie "verde" fue la predominante.
La presencia de aminas biógenas en los vinos se ha asociado con numerosos efectos fisiológicos no deseables. La formación de aminas biogénicas en los vinos depende de la presencia de ciertos microorganismos, la presencia de los precursores de aminoácidos, el período de contacto entre la uva-mosto con los hollejos, la longitud de la fermentación alcohólica, la concentración de dióxido de azufre, el pH y el tiempo de contacto del vino con las levaduras de lías. En los grupos microbianos, la capacidad de producir aminas biogénicas es una característica de la cepa, se conoce una gran variación en cuanto al tipo y a la cantidad de productos de aminas biogénicas de diferentes cepas de la mismas especies.
Se han identificado once aminas biogénicas (cadaverina, amina iso-pentilo, histamina, triptamina, feniletilamina, etilamina, etanolamina, espermina, espermidina, putrescina y tiramina), el contenido total de aminas biógenas en los vinos varió entre 9,29 y 14,41 mg/L en los vinos Muscat Ottonel y entre 4,42 y 20,4 mg/L en los vinos Aligoté, con la mención de que en la muestra de control se registraron valores significativamente más bajos que en las variantes experimentales estudiados. Cualquiera que sea la variedad o cepa de levadura utilizada, la etanolamina mostró el valor más alto entre todas las aminas cuantificadas.
El índice total de polifenoles (IPT) o el índice de OD280 expresa el contenido de compuestos fenólicos totales (ácidos fenólicos, taninos y sustancias de color) en el vino, que tienen valores de entre 3 y 15 en los vinos blancos y entre 20 y 100 en los rojos. Todas las variantes estudiadas tenían valores más bajos que este índice porque los vinos se obtienen a partir de uvas blancas, que acumulan pequeñas cantidades de compuestos fenólicos en comparación con las uvas negras y también se ha de tener en cuenta que la vinificación se hizo sin tener el mosto de uva en contacto con las partes sólidas de la uvas (pieles, semillas) para permitir la extracción de estos compuestos al vino. Las pequeñas diferencias observadas entre las variantes, pueden explicarse por la acción de levaduras metabolizando el ácido fenólico u otros procesos que deben ser fundamentada por estudios adicionales.
La determinación de las características cromáticas mostró que los vinos de color más intenso se obtuvieron mediante el uso de la cepa de levadura Fermactive Thyol® para los vinos Muscat Ottonel y Fermol Cryoaromae® para los vinos Aligoté. Por el contrario, el uso de la levadura Fermactive AP® caracteriza a los vinos con la menor intensidad de color en las dos variedades estudiadas. También hay diferencias significativas en el color y el tono entre la muestra de control y la levadura utilizada, independientemente de la variedad de uva utilizada.
No hay diferencias visuales perceptibles en términos de color entre los vinos obtenidos mediante la fermentación del mosto Muscat Ottonel con Cruz Evolution® y Fermol Cryoaromae®, así como los de Aligoté fermentados con ZYMAFLORE X16® y Fermol Aromatic® respectivamente Fermol Aromatic® y Fermactive AP® . Todos los otros vinos se pueden distinguir visualmente.
Por último, el análisis organoléptico realizado por catadores expertos, utilizando una escala hedónica de 1 a 10, mostró una preferencia por los vinos obtenidos con la levadura Cruz Evolution® y las uvas moscatel Ottonel. Los vinos obtenidos de los mostos Aligoté y fermentados con levadura A2B, también fueron preferidos entre todas las levaduras probadas con esta variedad de uva.
