Resumen de Análisis bioquímico de las proteínas de reparación del DNA KU y ligasa D de Bacillus Subtilis
Bacillus subtilis en una bacteria Gram-positiva formadora de esporas provista del sistema de reparación de roturas de las dos cadenas del DNA mediante la Unión de Extremos No Homólogos (NHEJ). Este sistema está constituido por la proteína de unión a DNA Ku (BsuKu) que se une a las roturas y recluta a la Ligasa D dependiente de ATP (BsuLigD) que posteriormente cataliza el relleno de los pequeños gaps que pudieran surgir durante el alineamiento de los extremos y el sellado de los nicks resultantes, contribuyendo a la estabilidad genómica durante la fase estacionaria y la germinación de las esporas.
Hasta el momento, las únicas funciones descritas para la proteína Ku procariota eran la unión a los extremos del DNA procedentes de roturas y el reclutamiento de la LigD para su posterior procesamiento y reparación. En esta Tesis Doctoral, se ha identificado la presencia de una actividad AP/5´-dRP liasa en BsuKu, capaz de reconocer y procesar sitios abásicos (AP) tanto en ssDNA, dsDNAs con extremos 5´-protuberantes y romos, así como en moléculas de DNA sin extremos. Esta nueva actividad de BsuKu, en coordinación con las actividades de polimerización y ligasa de BsuLigD, hacen posible la unión eficiente de fragmentos de DNA portadores de sitios AP próximos a extremos 5´-protuberantes. Además, hemos demostrado la presencia de la actividad AP-liasa también en la proteína Ku de la bacteria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, hecho que nos permite expandir nuestros resultados a otras proteínas Ku bacterianas.
Por otra parte, hemos identificado la presencia de una actividad dRP-liasa localizada en el dominio ligasa N-terminal de la proteína BsuLigD. Esta actividad, junto con las de polimerización y ligación, permite la reparación eficiente de un DNA portador de un sitio AP en una reacción reconstituida in vitro de Reparación por Escisión de Bases (BER). El requerimiento de los pasos de polimerización, eliminación del grupo 5´-dRP y ligación final, junto con el hecho de que BsuLigD y Nfo (la AP-endonucleasa de la espora), confieren a las esporas resistencia a la desecación, sugiere que BsuLigD podría estar participando activamente en una potencial vía BER en la espora. Hemos demostrado que la actividad dRP-liasa no es específica de BsuLigD, sino que se encuentra también en la de P. aeruginosa, permitiéndonos extrapolar nuestras observaciones al resto de LigDs bacterianas.
Asimismo, se ha determinado que BsuLigD tiene una actividad AP-liasa clásica en sustratos de DNA con extremos 5´-recesivos. Esta actividad requiere la presencia de metal, así como la unión (aunque no la incorporación) en el centro activo de polimerización del nucleótido correcto que habría de reemplazar el sitio AP tras su eliminación, sugiriendo la necesidad de la formación de un complejo preternario estable para que se lleve a cabo el procesamiento del sitio AP a la espera de la posterior reacción de ligación a un primer.
Por último, se ha mostrado la capacidad de BsuLigD de incorporar ribonucleótidos frente a lesiones en el molde de moléculas de DNA, tales como 8-oxodG, timidin-glicol y 5-hidroxi desoxicitidina, y la posterior ligación del producto elongado a un extremo 5´-P. Estos resultados podrían implicar a esta proteína no solo en las rutas NHEJ y BER, sino también en la ruta de tolerancia al daño en el DNA conocida como Síntesis a Través de Lesión.
