Identificación de nuevos componentes de la ruta tor de fusaium oxyporum y determinación de su papel en patogénesis
- Autores: Gesabel Yaneth Navarro Velasco
- Directores de la Tesis: Antonio Di Pietro (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: M. Isabel G. Roncero (presid.), Rosa María Ruiz Vazquez (secret.), José Manuel Pérez Martín (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Dª Gesabel Yaneth Navarro Velasco El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis:
1. Introducción o motivación de la tesis El crecimiento infeccioso de patógenos fúngicos es controlado por distintas señales ambientales, tal como el estado de nutrientes. El hongo Fusarium oxysporum es un patógeno del suelo causante de la marchitez vascular, una enfermedad que provoca pérdidas importantes en a un amplio rango de especies de plantas. Además, F. oxysporum es un patógeno oportunista capaz de producir infecciones en humanos, ello queda reflejado en el aumento de casos de pacientes inmunodeprimidos con infecciones sistémicas que, en algunas ocasiones, son letales. La capacidad de una única cepa de F. oxysporum de causar enfermedad tanto en plantas de tomate como en ratones inmunodeprimidos hace que esta sirva de modelo para el análisis genético de la patogenicidad en plantas y animales.
2. Contenido de la investigación El presente trabajo tuvo como primer objetivo poner a punto el uso de la polilla de la cera Galleria mellonella como modelo de infección alternativo al ratón, para profundizar en el estudio de los mecanismos de virulencia de F. oxysporum en animales. F. oxysporum fue capaz de proliferar en larvas de G. mellonella y matar al hospedador tras inyectar microconidios en el hemocele. La mortalidad de las larvas dependía de la dosis de inóculo y fue significativamente más rápida a 30ºC que a 37ºC. Mutantes de F. oxysporum previamente examinados en plantas de tomate y ratones inmunodeprimidos fueron inoculados en Galleria, observándose una buena correlación entre los dos modelos animales de infección. Por tanto, G. mellonella representa un sistema útil de coste asumible y éticamente aceptable, para el estudio de los mecanismos de virulencia de F. oxysporum en animales.
La segunda parte del trabajo se centró en la identificación y caracterización de distintos componentes de la cascada TOR en F. oxysporum y el papel de dicha ruta en el desarrollo y la virulencia del hongo. La proteína quinasa TOR está presente en todos los organismos eucariotas y controla el crecimiento y la proliferación celular en respuesta a nutrientes y otros estímulos ambientales. Actualmente se desconoce el papel de dicha ruta en la patogénesis fúngica. El análisis in silico del genoma de F. oxysporum, reveló la existencia de genes ortólogos de varios componentes de la ruta TOR caracterizados en mamíferos y en Saccharomyces cerevisiae. Para estudiar la función de estos componentes en F. oxysporum, se crearon una serie de mutantes mediante transformación genética y recombinación homóloga.
El primer aspecto abordado fue el papel del gen rim15, responsable de una quinasa regulada negativamente por TOR, que controla la entrada en la fase de quiescencia G0. Aunque la deleción de rim15 no tuvo un efecto significativo en el crecimiento y el desarrollo del hongo, si causó una disminución de los síntomas de enfermedad durante la infección de plantas y de G. mellonella.
Por otro lado, se llevó a cabo la mutación dirigida de cuatro componentes que funcionan aguas arriba de TOR: los supuestos transportadores de aminoácidos Slc1A5 y Slc7A5, la GTPasa Gtr1 y el regulador de GTPasas Tsc2 (complejo de esclerosis tuberosa 2). La pérdida de slc1a5 o slc7a5 afectó la capacidad de F. oxysporum para utilizar determinados aminoácidos tal como la leucina, y causó una disminución de los síntomas de la enfermedad tanto en plantas como en G. mellonella. La inactivación del gen tsc2 o la inserción de un alelo constitutivamente activo de gtr1 causaron una sobreactivación de la cascada TOR con efectos diferentes en los fenotipos de los mutantes. Los mutantes tsc2 mostraron una incapacidad de crecer en condiciones limitantes de nutrientes y de responder a distintos tipos de estrés. Por otro lado, los mutantes gtr1 mostraron un crecimiento y proliferación celular incrementados. En ambas clases de mutantes, la inhibición de TOR mediante rapamicina revirtió los fenotipos. La sobreactivación de TOR en los mutantes tsc2 y gtr1 redujo significativamente el crecimiento invasivo y provocó un retraso significativo en el desarrollo de la enfermedad, tanto en plantas como en animales. Los resultados demuestran que la ruta TOR juega un papel clave en el desarrollo y la patogénesis.
3. Conclusión 1. F. oxysporum es capaz de proliferar en larvas de G. mellonella y matar al hospedador.
2. Mutantes de F. oxysporum muestran una buena correlación en la virulencia en el modelo de Galleria y en el de ratón.
3. El ensayo de infección en larvas de G. mellonella representa un nuevo sistema útil, rápido, de coste asumible y éticamente aceptable para el estudio de los mecanismos de virulencia de F. oxysporum en animales.
4. La anulación dirigida del gen rim15 de F. oxysporum no produce alteraciones en el crecimiento y desarrollo, pero provoca una reducción de la virulencia en plantas de tomate y en larvas de G. mellonella.
5. Los mutantes ¿slc1a5 y ¿slc7a5 están afectados en la capacidad de utilizar determinados aminoácidos tal como la leucina.
6. Las mutaciones en los genes slc1a5 o slc7a5 causan una disminución de los síntomas de enfermedad durante la infección en plantas de tomate y en larvas de G. mellonella.
7. La inactivación de tsc2 o la expresión de un alelo constitutivamente activo de gen gtr1 causa una sobreactivación de la cascada TOR con diferentes efectos fenotípicos.
8. Tsc2 es importante para el crecimiento y desarrollo en fuentes pobres de nitrógeno y contribuye significativamente al crecimiento invasivo y a la virulencia en plantas de tomate y G. mellonella.
9. La activación constitutiva de gtr1 causa un aumento del crecimiento y la proliferación celular, y produce una reducción en la virulencia del hongo en plantas y en animales.
10. Tsc2 y Gtr1 realizan funciones independientes aguas arriba de TOR.
11. La sobreactivación de TOR produce un efecto represor sobre el crecimiento invasivo en el hospedador, reduciendo la virulencia tanto en plantas como en animales.
12. Los efectos de la sobreactivación de TOR por deleción de Tsc2 no se transmiten a través de la quinasa diana Sch9, sino mediante otra ruta aun desconocida aguas debajo de TOR que controla la invasividad y la virulencia de F. oxysporum.
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