Resumen de Centrifugación coloidal del semen crioconservado del perro para la selección de espermatozoides
RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE Dª LUCRECIA ALCARAZ ARANDA El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis:
1. Introducción o motivación de la tesis:
Las técnicas de crioconservación de esperma se emplean ampliamente en programas de reproducción asistida en perros, al eliminar los inconvenientes del coste, dificultad y tiempo empleado en el transporte de los animales, al permitir la reproducción de perros genéticamente superiores en aquellos casos en los que la monta natural resulta imposible, y al ofertar a los criadores la posibilidad de almacenar el esperma indefinidamente para su uso futuro. Pese a estas ventajas, la fertilidad potencial del esperma canino congelado se ve comprometida debido a las alteraciones en la estructura y fisiología del espermatozoide que se producen tras el proceso de congelación y descongelación. Por ello, nace la necesidad de desarrollar técnicas de congelación más eficaces y procedimientos que contrarresten las limitaciones del esperma congelado y, por tanto ayuden a mejorar la calidad de este.
Las técnicas de separación de esperma son capaces de mejorar significativamente las cualidades espermáticas. El fundamento de estos procedimientos es realizar una selección en la que separan espermatozoides móviles de inmóviles, eliminan el plasma seminal, los agentes crioprotectores y otras partículas de desecho; y al mismo tiempo inician la capacitación espermática obteniendo como resultado final, una muestra de esperma con una buena capacidad fecundante.
Un método de separación selectiva del esperma es la centrifugación empleando gradientes de densidad. PureSperm es un gradiente de densidad desarrollado para la reproducción asistida en la especie humana, el la que obtiene muy buenos resultados; no obstante, según la bibliografía consultada, aun no ha sido evaluado en el perro.
2. Contenido de la investigación:
El esperma canino de 18 perros de distintas razas y de edad comprendida entre 3 y 6 años, fue recogido mediante manipulación digital según Linde-Forsberg en 1991. La fracción espermática fue sometida al proceso de congelación y descongelación mediante el método Uppsala que describe Linde-Forsberg en 2002, con algunas modificaciones de dicho procedimiento.
Una vez descongeladas, cada muestra fue sometida a centrifugación a través del gradiente de densidad Puresperm® según las indicaciones del fabricante (Nidacon laboratorios AB, Goteborg, Suecia) con modificaciones.
Así, las muestras fueron centrifugadas mediante doble capa de gradiente (Puresperm 40 y 80), aplicándole simple y doble centrifugación, comparando cual de estas obtiene mejores resultados. Posteriormente fueron centrifugadas mediante monocapa de Puresperm 80, sometiéndolas a una centrifugación simple, con la cual previamente obtuvimos mejores resultados.
Las muestras, en fresco, tras su descongelación y tras ser sometidas a los procesos de centrifugación descritos, fueron valoradas. Los valores medios de los parámetros seminales estudiados (movimiento, morfología, integridad de membrana plasmática y acrosómica y actividad mitocondrial) fueron comparados entre todas las muestras frescas, crioconservadas y seleccionadas mediante el gradiente de densidad para valorar el efecto de Puresperm® sobre la calidad del esperma canino crioconservado.
Los objetivos específicos que se persiguen en este proyecto son:
Valorar el efecto del proceso de crioconservación sobre la calidad del esperma canino.
Testar la influencia de la centrifugación a través del gradiente de densidad Puresperm® del esperma canino crioconservado sobre la respuesta al proceso de congelación-descongelación.
Probar diferentes protocolos aplicables a los procesos de centrifugación del esperma canino, mediante el gradiente de densidad Puresperm®, con el fin de probar su eficacia en la especie canina.
3. Conclusiones:
De acuerdo a los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral, se pueden extraer las conclusiones que se enumeran a continuación:
- Primera Publicación: Centrifugation on PureSperm® density-gradient improved quality of spermatozoa from frozen-thawed dog semen. J. Dorado, L. Alcaraz, N. Duarte, J.M. Portero, D. Acha, S. Demyda, A. Muñoz-Serrano, M. Hidalgo. Theriogenology 2011, 76: 381-385.
La centrifugación a través del gradiente de densidad PureSperm® puede ser un método eficaz para mejorar la calidad del esperma canino dañado por el proceso de congelación-descongelación, y presumiblemente con la mayor capacidad fecundante potencial, debido a que la mayoría de parámetros de calidad espermática explorados aparecen significativamente mejorados con respecto a la suspensión original de esperma congelado-descongelado.
El lavado del pellet resultante de la centrifugación en gradiente de densidad redujo drásticamente la calidad seminal a la descongelación, indicando que la inclusión de este paso en el proceso de selección es innecesario.
- Segunda Publicación: Changes in the structutes of motile sperm subpopulations in dog spermatozoa after both cryopreservation and centrifugation on PureSperm® gradient. J. Dorado, L. Alcaraz, N. Duarte, J.M. Portero, D. Acha, M. Hidalgo. Animal Reproduction Science 2011, 125: 211-218.
Los resultados del presente estudio mostraron la existencia de cuatro subpoblaciones cinéticas tanto en el semen fresco, en las muestras no seleccionadas como en las seleccionadas de perro.
La crioconservación modificó significativamente tanto los parámetros específicos como la distribución de los espermatozoides entre las subpoblaciones.
El gradiente discontinuo PureSperm® es un método simple para mejorar la calidad del esperma canino dañado por el proceso de congelación-descongelación y, aunque esto debería ser confirmado experimentalmente, presumiblemente con la mayor capacidad fecundante potencial, ya que la Subpoblación 4 (espermatozoides muy veloces y con movimiento progresivo) fue la subpoblación más frecuentemente observada tras la preparación en el gradiente.
Finalmente, este estudio demostró que la estructura general de subpoblaciones cinéticas en el perro se mantuvo constante a pesar del efecto causado tanto por el proceso de crioconservación como por el de separación a través del gradiente PureSperm®.
- Tercera Publicación: Single-layer centrifugation through PureSperm® 80 selects improved quality spermatozoa from frozen-thawed dog semen. J. Dorado, L. Alcaraz, M.J. Gálvez, D. Acha, I. Ortiz, M. Urbano, M. Hidalgo. Animal Reproduction Science 2013, 140: 232-240.
La centrifugación en una sola capa del coloide PureSperm® 80 puede ser un método alternativo y eficaz para la mejora de la calidad del esperma canino dañado por el proceso de congelación-descongelación, y aunque esto debería ser confirmado experimentalmente, presumiblemente con la mayor capacidad fertilizante potencial, ya que la mayoría de los parámetros de calidad espermática explorados fueron significativamente mejores que los obtenidos en las muestras originales de esperma congelado-descongelado.
Además, la Subpoblación 2 (espermatozoides con alta velocidad y movimiento progresivo) se observó con mayor frecuencia tras la selección a través del coloide PureSperm® 80.
Por último, este estudio también demostró que la crioconservación modifica significativamente la distribución de los espermatozoides dentro de las subpoblaciones; sin embargo, la estructura general de las subpoblaciones espermáticas en perros se mantuvo constante a pesar del efecto causado por la crioconservación o selección a través de PureSperm® 80.
4. Bibliografía:
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Hollinshead et al.; Birth of lambs of a predetermined sex after in vitro production of embryos using frozen-thawed sex- and re-frozen-thawed ram spermatozoa. Reproduction, 2004.
Linde-Forsberg C. Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extended semen. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 1991.
Linde-Forsberg C. Hints on dog semen freezing, cryoextenders, and frozen semen artificial insemination. Proceedings from the Society for Theriogenology Meeting, Colorado Springs, 2002.
Mousset-Simeón et al.; Comparison of six density gradient media for selection of cryopreserved donor spermatozoa. Journal of Andrology, 2004.
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Sonderlund et al.; The silane coated silica particles for density gradient centrifugation in Vitro fertilization. Human reproduction, 2000.
