Mecanismos mediadios por linfocitos T implicados en el remodelado cardíaco patólogico en insuficiencia cardíaca
- Autores: Ane Miren Salvador Garicano
- Directores de la Tesis: María Alcaide Alonso (codir. tes.), Ana Clara Abadía Molina (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Fresno Escudero (presid.), Natalia Aptsiauri (secret.), Ángeles Álvarez (voc.), María del Carmen Ruiz Ruiz (voc.), Nikolaos G. Frangogiannis (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
La insuficiencia cardíaca (IC) es una patología crónica en la cual el tejido miocárdico modifica su fenotipo en respuesta a una variedad de factores (isquemia, hipertensión, autoinmunidad, enfermedades metabólicas etc.) con el objetivo de mantener una función contráctil adecuada. Estos cambios fenotípicos incluyen procesos de hipertrofia, deposición de colágeno e infiltración de leucocitos, los cuales en un inicio resultan suficientes para mantener una función cardíaca adecuada, pero que a largo plazo resultan ineficientes y llevan a IC crónica (1).
Al tratarse de una patológica compleja, son muchos los mecanismos que han sido investigados en las últimas décadas con el objetivo de comprender los sistemas disfuncionales que subyacen en el desarrollo de IC crónica (2). Entre estos factores, el sistema inmunitario y mecanismos pro-inflamatorios relacionados con él han sido recientemente asociados con el desarrollo de esta patología (3). Sin embargo, ensayos clínicos basados en inhibir la respuesta inflamatoria de forma sistémica han resultado ineficaces (4), subrayando la necesidad de investigar y comprender de forma específica los mecanismos inmunes e inflamatorios implicados en IC.
Con este objetivo, en la presente tesis doctoral postulamos la hipótesis de que en respuesta a sobrecarga de presión en el ventrículo izquierdo del corazón, el sistema inmunitario adaptativo se activa, con ello los linfocitos CD4+ se diferencian a sus subtipos efectores y se reclutan mediante mecanismos específicos al ventrículo izquierdo, contribuyendo al remodelado cardíaco patológico e IC. Para probar dicha hipótesis, hemos hecho uso del modelo de ratón basado en la constricción quirúrgica de la aorta transversa (TAC), la cual induce una sobrecarga de presión en el ventrículo izquierdo (5). Hemos aplicado dicha cirugía a ratones deficientes en linfocitos T (Tcra-/-) , deficientes en la molécula de adhesión ICAM1 (Icam1-/-) (6) o deficientes en el receptor mineralocorticoide selectivamente en células endoteliales (EC-MR-/-) (7), para determinar el papel de estos tipos celulares y moléculas en el desarrollo de IC. Con el objetivo de cuantificar la activación linfocitaria en ganglios linfáticos mediastínicos y en circulación sanguínea, así como su infiltración al ventrículo izquierdo, hemos hecho uso de técnicas histológicas y de citometría de flujo. Los parámetros de remodelado cardíaco patológico, como hipertrofia, fibrosis, inflamación y disfunción cardíaca, han sido analizados mediante PCR cuantitativa, técnicas histológicas, ecocardiografía no-invasiva y curvas hemodinámicas presión-volumen invasivas. Para la evaluación de moléculas de adhesión y quimioquinas implicadas en el reclutamiento linfocitario in vitro, hemos hecho uso de la cámara paralela de flujo laminar adosada a microscopio. Finalmente, para la creación del ratón knock-in, conteniendo secuencias loxP flanqueando el gen que codifica para ICAM1, nos hemos basado en la tecnología CRISPR-Cas9 (8) para el diseño de por un lado las secuencias sgRNA que guían a Cas9, y por otro lado, de las secuencias de oligonucleótidos a insertar en los extremos 5’ y 3’ del gen que codifica para ICAM1; para la validación de presencia de la inserción hemos hecho uso de métodos de genotipado específicos.
Inicialmente, describimos el papel esencial de los linfocitos T en el remodelado ventricular patológico en respuesta de sobrecarga de presión del ventrículo izquierdo, donde se observa una correlación temporal entre el reclutamiento linfocitario y la disfunción miocárdica, junto con cambios fenotípicos como hipertrofia y fibrosis ventricular. Además, se enaltece la importancia de los linfocitos T en estos procesos patológicos en las observaciones experimentales en ratones deficientes en linfocitos T, los cuales en respuesta al mismo insulto de sobrecarga de presión, mantienen una correcta función ventricular, sin desarrollar ni hipertrofia ni fibrosis.
Tras ello, determinamos los mecanismos de reclutamiento utilizados por los linfocitos T en su migración al ventrículo izquierdo. En estos estudios, observamos que la expresión endotelial de la molécula de adhesión ICAM1 está incrementada y juega un papel esencial en el reclutamiento de linfocitos T al miocardio como respuesta a la sobrecarga de presión, ya que en ausencia de ICAM1 (Icam1-/-) el número de linfocitos reclutados al ventrículo izquierdo es significativamente inferior a ratones que expresan ICAM1. Además de ello, los ratones deficientes en Icam1 están protegidos de desarrollar remodelado cardiaco patológico, caracterizado por ausencia de fibrosis y disfunción cardíaca, a pesar del mismo grado de activación linfocitaria.
Al determinar los factores que llevan a un incremento de expresión endotelial de ICAM1 en el contexto de sobrecarga de presión, observamos que probablemente las citoquinas pro-inflamatorias sobre-expresadas en el miocardio están implicadas en la activación endotelial, y no mecanismos endocrinológicos como la señalización que ocurre cuando la hormona aldosterona se une al receptor mineralocorticoide en el endotelio vascular (EC-MR). Nuestros resultados en ratones deficientes en dicho receptor exclusivamente en células endoteliales indican que EC-MR no es esencial en el incremento de expresión de ICAM1 ni en el reclutamiento de células T y monocitos pro-inflamatorios al miocardio, a pesar de que presenta cierta importancia en la función sistólica en respuesta a sobrecarga de presión.
Adicionalmente, indicamos los receptores de quimioquinas y sus ligandos implicados en la quimiotaxis y el tropismo de los linfocitos T hacia el ventrículo izquierdo en el desarrollo de IC. Dentro del contexto de sobrecarga de presión, la expresión ventricular de las quimioquinas CXCL9 y CXCL10 se encuentra incrementado, al igual que el porcentaje de linfocitos T que expresan su correspondiente receptor CXCR3 en los nódulos linfáticos que drenan el miocardio. Además, los linfocitos T CXCR3+ expresan mayores niveles de la integrina LFA1, principal ligando de ICAM1. Estudios in vitro indican que en presencia de dichas quimioquinas la adhesión de linfocitos CXCR3+ a ICAM1 está incrementada, la cual resulta ser dependiente de LFA1.
Dado que otros tipos celulares expresan ICAM1 además de las células endoteliales, y con el objetivo de determinar el papel de ICAM1 en los diferentes tipos celulares implicados en los fenómenos patológicos asociados a IC, hemos comenzado a desarrollar el ratón con el gen que codifica para ICAM1 flanqueado por secuencias loxP, para así poder generar ratones deficientes en Icam1 específicamente en diferentes tipos celulares. Para ello, hemos hecho uso de la tecnología CRISPR/Cas9 emergente, mediante la cual hemos inicialmente microinyectado oligonucleótidos con secuencias homólogas y loxP para su inserción por recombinación en las regiones 5’ y 3’ del gen que codifica ICAM1. Dado el bajo nivel de rendimiento de esta estrategia también hemos considerado la producción de un único plásmido que incluya ambas regiones loxP de inserción, que flanqueen el exón 1 del gen que codifica ICAM1, para así una vez microinyectado, la inserción se produzca en un único paso y con ello idealmente se aumente el porcentaje de inserción exitosa y generemos el ratón Icam1fl/fl.
Los resultados de esta tesis doctoral indican que existe una clara respuesta inmunitaria durante el desarrollo de IC mediada por linfocitos T. El hecho de que la citoquina IFNγ, el factor de transcripción Tbet y el receptor de quimioquinas CXCR3 se encuentren incrementados en el ventrículo izquierdo de ratones con IC sugiere que la respuesta es mediada por células Th1. Los mecanismos que inician dicha respuesta también quedan por explorar, pudiéndose considerar una respuesta T clásica hacia antígenos cardíacos que queden expuestos debido a la ausencia de tolerancia inmunológica en el contexto de sobrecarga de presión miocárdica, o a antígenos no cardíacos que activen a los linfocitos T. No hay que descartar la posibilidad de que los linfocitos T se activen en respuesta a patrones moleculares asociadas a daño tisular (DAMP) (9, 10). Futuros estudios en ratones deficientes en moléculas clave en el desarrollo de respuestas dependiente e independientes de antígeno determinaran el tipo de linfocitos T, la especificidad de antígeno y si además existe una activación independiente de antígeno en la respuesta inmunitaria durante la IC. Nuestros resultados además indican el papel esencial de ICAM1 en el reclutamiento de linfocitos T al ventrículo izquierdo, cuya sobreexpresión endotelial en el miocardio es independiente de EC-MR y posiblemente mediada por citoquinas pro-inflamatorias producidas de forma local en el miocardio en IC. Dada la ausencia de disfunción cardíaca de los ratones deficientes en ICAM1, queda por explorar la posibilidad de que los cardiomiocitos expresen ICAM1 en respuesta al estrés hemodinámico (11), y mediante ella medien la interacción de linfocitos T infiltrados y cardiomiocitos, llevando a disfunción miocárdica. En un futuro próximo, mediante el uso de los ratones Icam1fl/fl que estamos desarrollando, podremos describir en mayor profundidad el papel extra-endotelial de ICAM1 y con ello la necesidad de interacción directa entre linfocitos T infiltrados y células cardíacas que lleven al remodelado cardíaco patológico. Adicionalmente, quedan por describir los mecanismos específicos mediante los cuales EC-MR regula la función sistólica, los cuales posiblemente estén relacionados con la mejora de la función coronaria en ausencia de EC-MR y explique parcialmente el beneficio terapéutico de los fármacos antagonistas de MR (12), independientemente del desarrollo de fibrosis y reclutamiento leucocitario al ventrículo izquierdo en IC.
En resumen, en la presente tesis doctoral describimos el papel de la respuesta inmunitaria adaptativa, los mecanismos inflamatorios, las moléculas de adhesión endotelial y las quimioquinas que median el cardiotropismo de los linfocitos T durante el desarrollo de IC, muchos de ellos potenciales dianas para el tratamiento de esta crónica enfermedad.
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