Resumen de Importancia de las modificaciones post-traduccionales en la estabilidad y tráfico de cah1 e identificación de n-glicoproteínas en el cloroplasto de arabidopsis thaliana
Este trabajo se centra en el análisis de la N-glicosilación, una modificación post-traduccional muy común en proteínas. En concreto, se estudia el papel de la N-glicosilación en la estabilidad, tráfico y funcionalidad de proteínas cloroplásticas de Arabidopsis thaliana. Para ello, se realizan análisis en versiones mutadas de la glicoproteína usada como modelo CAH1, una carbónico anhidrasa codificada en el núcleo de la célula, que se transporta al cloroplasto a través del sistema de endomembranas, siguiendo una ruta diferente a la usada por la mayoría de proteínas importadas por éste orgánulo. En el proceso de transporte se modifica post-traduccionalmente adquiriendo N-glicanos y, potencialmente, un puente di-sulfuro. Se analiza la influencia de dichas modificaciones en el plegamiento y transporte de CAH1, así como la influencia del extremo carboxilo terminal. Por otro lado, el papel fisiológico de los N-glicanos complejos, procesados y madurados al paso de la N-glicoproteína por el aparato de Golgi no está muy claro en plantas. De hecho, mientras mutantes incapaces de generar N-glicanos complejos producen fenotipos patológicos en mamíferos, mutaciones análogas en plantas no parecían presentar un fenotipo alterado. Sin embargo, estudios recientes sugieren la existencia de una relación de las modificaciones en glicosilación que tienen lugar en el aparato de Golgi, con el desarrollo normal de la planta bajo condiciones de estrés abiótico. Para profundizar en este hallazgo, en este trabajo se han utilizado plantas carentes de ciertos residuos glucídicos en sus N-glicanos, crecidas en condiciones de estrés salino, determinando diversos parámetros fisiológicos como el crecimiento de raíces o la capacidad de sintetizar pared celular. Por último, distintos estudios indican que la ruta de transporte al cloroplasto asociada al sistema de endomembranas no es exclusiva CAH1, si no que existen otras proteínas que pueden seguir rutas similares y/o alternativas. Por ello, se planteó la identificación de otras N-glicoproteínas que tuvieran características similares a la ya mencionada CAH1. Esto implicaría no sólo la constatación de la elevada complejidad del sistema de transporte de proteínas dentro de la célula, sino la posibilidad de implementar o adaptar estas rutas de transporte a la producción de proteínas recombinantes de interés farmacéutico y/o industrial. Para ello se procedió a realizar estudios proteómicos empleando como herramienta una serie de mutantes con una ruta de transporte de moléculas al cloroplasto interrumpida. Tanto la N-glicosilación de proteínas cloroplásticas, como los sistemas que rigen el transporte de este tipo de proteínas en plantas, se encuentran aún en estadios muy tempranos de investigación, siendo necesaria una mayor profundización tanto en la caracterización de las funciones de éstos residuos de azúcares en las estructuras proteicas, como en el tipo de sistema y elementos implicados en su transporte.
The aim of this work is to analyze the role of N-glycosylation of proteins, a common post-translational modification (PTM), on the stability, traffic and function of plastid proteins from Arabidopsis thaliana. With that aim, it was used as model CAH1, a nuclear encoded ¿ carbonic anhydrase that is transported into the chloroplast via the endomembrane system, a pathway different to the canonical one used for most of the proteins targeted to this organelle. During its transport process to the organelle, CAH1 acquires N-glycans and, potentially, a disulphide bond. The role of these PTMs on folding and transport of CAH1, as well as the influence of C-terminus are analyzed. On the other hand, physiological function of complex N-glycans, those resulting from the N-glycan processing and maturation during the pass of the N-glycoprotein through the Golgi apparatus, are not very well understood in plants. In fact, whereas mutants unable to synthesize complex N-glycans produced pathological phenotypes in mammals, in plants seems to provoke no apparently altered phenotype. However, recent studies have suggested a relationship between N-glycan modifications and normal plant development under abiotic stress conditions. To further explore this finding, we have used plants defective in specific complex N-glycan residues under salt stress conditions, and determined several physiological parameters, as root growth or cell wall formation capacity. Additionally, several studies indicate that the route of chloroplast import of proteins associated to the endomembrane system is not exclusive of CAH1, and that there may be other proteins targeted to the organelle using similar or alternative pathways. Therefore, the identification of other N-glycoproteins sharing some characteristics than the mentioned CAH1 has risen. This finding not only would confirm the high complexity of the transport system of proteins within the cell, but it would allow adapting these routes for the production of recombinant proteins with pharmaceutical and/or industrial interest. For that, we designed a proteomic strategy, based on the use of mutants defective in a route of transport of molecules to the chloroplast. The knowledge of both, N-glycosylation of plastid proteins and transport process of these proteins in plant cells, are still in very preliminary stages. Further research is needed to characterize the function of N-glycan residues in plants as well as the process and the elements involved on their transport to the organelle
