Estudi de l'apoptotsi induïda per inhibidors farmacològics de les CDKS. Caracterització dels sinergismes amb taxoides i nutlina-3.

• Autores: Judit Ribas i Fortuny
• Directores de la Tesis: Jacint Boix Torras (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Lleida ( España ) en 2005
• Idioma: catalán
• ISBN: 84-689-5789-5
• Depósito Legal: L-1292-2005
• Tribunal Calificador de la Tesis: Laurent Meijer (presid.), Víctor J. Yuste Mateos (secret.), José Javier Naval Iraberri (voc.), Joan Gil Santano (voc.), Neus Agell Jané (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen

  • Lolomoucina i la roscovitina són dos inhibidors de les cinases dependents de ciclines (CDKs) que actuen competint pel lloc dunió de lATP. Presenten una alta especificitat invitrodavant de la CDK1, 2, 5, 7, 9 i les ERKs. Aquest perfil inhibidor els confereix unes amplies perspectives en la teràpia antitumoral.

    En aquest treball, hem mostrat que la línia neuroblàstica de les SH-SY5Y i la promielocítica de les HL60, morien apoptòticament en resposta a ambdós fàrmacs. Una caracterització més extensa del procés, va evidenciar que la sobre expressió de Bcl-2 o Bcl-XL no conferien resistència. En canvi, la inhibició general de les caspases amb z-VAD-fmk, frenava parcialment la mort. En conseqüéncia, vam hipotetitzar que ens trobàvem davant duna via extrínseca dapoptosi, dependent de lactivació de la caspasa 8 (CASP8) o de la caspasa 10 (CASP10). Tanmateix, les CASP8/10 no sexpressen a les SH-SY5Y ja que els seus gens han estat metilats, i és més, no vam observar que es reexpressessin en resposta a lolomoucina o la roscovitina. En conclusió, la implicació al nostre paradigma experimental duna via extrínseca canònica dapoptosi va ser descartada. Daltra banda, la inhibició de la s¿ýntesi de proteïnes protegia les SH-SY5Y de lapoptosi. Curiosament, vam observar lexistència de sinergisme de rescat entre el z-VAD-fmk i ,per exemple, la cicloheximida, fet que suggeria lexistència de diferents vies apoptòtiques en diferents subpoblacions del cultiu cel·lular. La manca de toxicitat del tractament amb PD98059 o UO126, dos inhibidors de la via Erk1/2, anava en contra de que la inhibició de Erk1/Erk2 fos la causa de lapoptosi. És més, el tractament amb olomoucina i roscovitina induïa la fosforilació i subseqüent activació de les Erk1/2. Sorprenentment, al nostre model, lisoolomoucina, un isòmer inactiu de lolomoucina, causava els mateixos efectes sobre les ERKs. Basant-nos en els resultats diso-olomoucina, vam concloure que la fosforilació de les ERKs i la seua subseqüent activació, no estaven implicats en els fenòmens dapoptosi, proliferació i diferenciació. Finalment, vam mostrar que les SH-SY5Y diferenciades esdevenien resistents a lolomoucina i a la roscovitina, fet que recolzava el paper de la inhibició de les CDKs en tant que esdeveniment iniciador de la cascada apoptòtica. Daltra banda, lolomoucina i la roscovitina són cada cop més estudiats en el context de la teràpia combinatòria enfront del càncer. Als nostres treballs, hem utilitzat la R-roscovitina, un dels dos estereoisòmers de la roscovitina. La combinació amb el docetaxel (DTX) no era sinèrgica induint mort. En canvi, la R-roscovitina sensibilitzava les SH-SY5Y a lapoptosi induïda per la nutlina-3, un nou i prometedor f`armac inductor de la via p53.

    RESUMEN La olomoucina y la roscovitina son dos inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuyo mecanismo de acción es competir con el ATP por la unión a la enzima. Presentan una alta selectividad in vitroante la CDK1, 2, 5, 7, 9 y las ERKs. Este perfil inhibidor les confiere amplias perspectivas en la terapia antitumoral. En este trabajo, hemos mostrado que la línea de las SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, y la de las HL-60, derivada de una leucemia promielocítica, morían apoptoticamente en respuesta a ambos fármacos. Una caracterización más amplia del proceso apoptótico, evidenció que la expresión forzada de Bcl-2 o de Bcl-XL no conferían resistencia ante ninguna de nuestras drogas. En cambio, sí se hacían parcialmente más resistentes cuando eran tratadas con un inhibidor general de las caspasas (z-VAD-fmk). En consecuencia, nuestra hipótesis fue que nos hallábamos ante una apoptosis por vía extrínseca iniciada por la caspasa 8 (CASP8) y/o la caspasa 10 (CASP10). Curiosamente, dichas caspasas no se expresan en las SH-SY5Y debido a un proceso de metilaci¿on génica, y pudimos ver que el tratamiento tampoco inducía su reexpresión. En conclusión, descartamos que las SH-SY5Y iniciasen una vía extrínseca canónica en respuesta a nuestras drogas. Por otro lado, la inhibición de la síntesis proteica en nuestro modelo frenaba la apoptosis. Es más, el z-VAD-fmk junto con, por ejemplo, la cicloheximida, presentaban un sinergismo en el rescate. Esto sugería la coexistencia en nuestro cultivo de distintas subpoblaciones capaces de iniciar diferentes vías apoptóticas. El tratamiento con PD98059 o UO126, dos inhibidores de la via de Erk1/2, se mostró inocuo a la hora de inducir muerte, por lo cual descartamos que la inhibición de Erk1/2 fuera la responsable de la apoptosis. Sorprendentemente, el estudio del estado de fosforilación de Erk1/2, nos permitió constatar que éstas se activaban en respuesta a la olomoucina y la roscovitina. Más sorprende aún, resultó el hecho que la iso-olomoucina, un isómero inactivo de la olomoucina, causara los mismos efectos sobre Erk1/2. Esto nos permitió afirmar que no existía correlación entre la fosforilación de Erk1/2 y la inhibición de las CDKs. En base principalmente a los resultados de la iso-olomoucina, pudimos afirmar que la fosforilación de las ERKs y su subsiguiente activación, no se correlacionaban con la apoptosis, proliferación y diferenciación celular. Finalmente, evidenciamos que las SH-SY5Y diferenciadas se volvían resistentes a la olomoucina y a la roscovitina, hecho a favor de que la inhibición de las CDKs fuera el evento iniciador de la cascada apoptótica. Alternativamente, la olomoucina y la roscovitina están siendo cada vez más estudiadas en el contexto de la terapia combinatoria frente al cáncer. En nuestros experimentos, utilizamos también la R-roscovitina, uno de los dos estereoisómeros de la roscovitina. En su combinación con el docetaxel (DTX), no observamos sinergismo. El caso contrario sucedi¿o cuando fue administrada junto a la nutlina-3, un nuevo y prometedor inductor de p53. Vimos como la R-roscovitina sensibilizaba las SH-SY5Y a la apoptosis inducida por la nutlina-3.

    RESUME Lólomoucine et la roscovitine sont deux inhibiteurs des kinases d¿ependantes de cyclines (CDKs) qui agissent par inhibition competitive via le site dunion de lATP. Son profil inhibiteur est tr`es prometteur dans le traitement du cancer. Pr¿esentent une grande spécificité in vitroface aux CDK1, 2, 5, 7, 9 e aux ERKs. Dans ce travail, nous avons d¿emontré que la lignée neuroblastique SH-SY5Y et la promyélocitique HL-60, mouraient apoptotiquement en réponse àces drogues. Une plus large caractérisation de lapoptose dans les SH-SY5Y a mis enévidence que la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-XL ne se traduisait par une augmentation de la résistance au traitement. Cependant, le traitement avec un inhibiteur général des caspases (z-VAD-fmk) présentaient des effets protecteurs partiels. Au vu de ces résultats, notre hypothèse reposait sur límplication dune voie extrinsèque dapoptose qui d¿ependait de lactivation de la caspase 8 (CASP8) ou de la caspase 10 (CASP10). Néanmoins, la m¿ethylation des gènes des CASP8 et 10 dans les SH-SY5Y empèche lexpression de ces protéines et, plus encore, lolomoucine et la roscovitine nínduiraient pas la réexpression de ces caspases. En conclusion, lapoptose par une voie extrinsèque classique pouvait ètreécartée dans notre paradigme expérimental. Dun autre coté, les inhibiteurs de la synthèse des protéines protégeaient les SH-SY5Y de lapoptose. De manière surprenante, on avait observé lexistence de synergie dans la protection avec z-VAD-fmk et, par exemple, le cycloheximide.

    Ce fait suggérait la présence de différents sous-poupulations cellulaires dans les SH-SY5Y qui engageaient des voies apoptotiques distinctes. Le manque deffets toxiques du PD98059 or UO126, deux inhibiteurs de la voie dErk1/2, avait écarté linhibition de Erk1/Erk2 comme la responsable de lapoptose.

    Plus encore, lolomoucine et la roscovitine induisaient la phosphorylation et subséquente activation dErk1/Erk2. De manière surprenante, liso-olomoucine, un isomère inactif de lolomoucine, induisait aussi la phosphorylation et lactivation dans notre modèle cellulaire. Sur base de ces résultats, nous avons conclu que la phosphorylation dErk1/Erk2 et son activation, navait pas un corr¿elat avec lapoptose, la prolifération et la différentiation cellulaire. Finalement, nous avons mis en évidence que les SH-SY5Y différentiées devenaient résistantes à lolomoucine ou à la roscovitine. Ce fait suggérait que linhibition des CDKs avait un role dans le d¿eclenchement de lapoptose. Alternativement, lolomoucine et la roscovitine sont de plus en plus étudiées dans le contexte de la th¿erapie combinatoire face au cancer.

    Jai utilisé la R-roscovitine dans nos expériences, lun des deux stéréoisomères de la roscovitine. La combinaison avec le docétaxel (DTX) navait pas des effets l¿etaux synergiques, en revanche la R-roscovitine sensibilisait les SH-SY5Y à lápoptose par la nutline-3, un nouvel agent inducteur de la voie p53.

    SUMMARY Olomoucine and roscovitine are two ATP-competing inhibitors of cyclin-dependent kinases (CDKs) displaying a promising profile as anticancer agents. They exhibit in vitroselectivity against CDK1, 2, 5, 7, 9 and ERKs. In this work, we have showed that SH-SY5Y neuroblastoma and HL-60 promielocytic cell lines died by apoptosis in response to both drugs. An extensive characterization of the process in SH-SY5Y cells has shown that neither Bcl-2 nor Bcl-XL overexpression conferred any resistance to both drugs. However, a partial protective effect was detected when cells were treated with a general inhibitor of caspases (z-VAD-fmk). Therefore, the involvement of an extrinsic pathway mediated by Caspase 8 (CASP8) or Caspase 10 (CASP10) could be hypothesised. CASP8/10 are known not to be expressed in SH-SY5Y because of gene silencing and we have found no re-expression was induced by either olomoucine or roscovitine. In conclusion, a canonical extrinsic pathway has been discarded in SH-SY5Y cells facing these drugs. On the other hand, protein synthesis inhibitors protected SH-SY5Y cells from apoptosis.

    Interestingly, a synergism in cell protection was observed between z-VAD-fmk and, for instance cycloheximide. This suggested different apoptotic pathways occurring in distinct subpopulations of the cell culture. No lethality was found when cells were treated with either PD98059 or UO126 drugs, two inhibitors of the Erk1/2 pathway, thus discarding, this inhibition as the cause of apoptosis. Furthermore, olomoucine and roscovitine induced the phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 proteins.

    Interestingly, iso-olomoucine, an inactive isomer of olomoucine, caused the same effect in our cell model.

    Therefore, no correlation existed between Erk1/2 phosphorylation and CDK inhibition. Based mainly on the iso-olomoucine results, we concluded that phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 were not involved in apoptosis, proliferation and differentiation of the cells. Finally, we show that differentiated SH-SY5Y cells became resistant to either olomoucine or roscovitina, thus providing support for CDK inhibition as the initiating event of these apoptotic processes. Olomoucine and roscovitine are being increasingly studied in the context of combinatorial therapy for cancer. In our studies, we have also used R-roscovitine, the right stereoisomer of roscovitine. No synergism was found when combined with docetaxel (DTX). On the contrary, R-roscovitine sensitized SH-SY5Y cells to nutlin-3 induced apoptosis, being nutlin-3 a new promising inductor of the p53 functions.