Structural and Functional Studies of Melibiose permease of escherichia coli
- Autores: Yibin Lin
- Directores de la Tesis: Esteve Padrós i Morell (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2012
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Pere Garriga Solé (presid.), José Luis Vázquez Ibar (secret.), Jordi Benach Andreu (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
Els transportadors de membrana tenen un paper molt important en el manteniment de la fisiologia normal de l'organisme, així com en l'eficàcia i la seguretat dels fàrmacs. Per tant, és molt important obtenir noves dades de l'estructura i la funció d'aquest tipus de proteïnes de membrana. La melibiosa permeasa (MelB), un transportador de membrana, és de gran interès, ja que pot utilitzar diferents sucres (ja sigui ?- o ?-galactòsids) i cations (Na+, Li+ i H +), mentre que altres simportadors com la lactosa permeasa, un membre de la important superfamília de facilitadors, utilitza només H+. Això implica que la MelB ha de presentar algunes característiques úniques en quant al reconeixement i el transport dels substrats. L'estudi en profunditat de l'estructura i funció de la MelB ens pot proporcionar millores clau en la comprensió del mecanisme de co-transport dels transportadors de membrana. Les dades actuals d’índole bioquímica, biofísica o estructural de la MelB no ens proporcionen una escena clara del mecanisme de reconeixement de substrats, i tampoc expliquen la reorganització estructural que es produeix i que en última instància, genera els canvis conformacionals necessaris per al transport a través de la membrana. En aquesta tesi, he utilitzat tècniques espectroscòpiques, així com mètodes de cristal·lografia de macromolècules per explorar l'estructura i funció de la MelB. En primer lloc, m'he centrat en l’estudi del mutant R149C, el qual no pot unir el sucre i no pot transportar. En segon lloc, he estudiat el paper de l'hèlix V a partir de la substitució individual dels aminoàcids per cisteïna, per mutagènesi dirigida. Finalment, hem cristal·litzat el transportador MelB i hem aplicat difracció de raigs X per intentar obtenir la seva estructura 3D. Els resultats mostren que la mutació R149C fixa la MelB en una conformació oberta cap al citoplasma. Per tant, l’Arg149, situada probablement al final del cantó citoplasmàtic de l'hèlix V, és una cadena lateral crucial per al mecanisme de reorientació de la MelB. Un altra resultat important és que l’Ala155, situat probablement cap el punt mig de l’hèlix V, és un residu essencial tan per la unió de Na+ com de melibiosa, ja que el mutant A155C perd absolutament qualsevol capacitat d'unir els substrats. Per altra banda, es proposa que l'hèlix V ha d'estar involucrada en el mecanisme de reorientació de la MelB. Després de diversos intents de cristal·litzar la proteïna, hem estat capaços d'obtenir cristalls de la MelB silvestre i del mutant R149C, solubilitzats en ?-DDM. Després de l'optimització, el millor cristall difracta a uns 8 Å a la font de radiació sincrotró.
