Estudios funcionales y estructurales en quinasas dependientes de ADP relacionadas con el metabolismo de glucosa en Archaea

• Autores: Alejandra Margarita Herrera Morandé
• Directores de la Tesis: María Cristina Vega Fernández (dir. tes.), Josefa Badia Palacín (dir. tes.), Victoria Guixé Leguia (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2015
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Laura Baldoma (presid.), Sandra Villegas Hernández (secret.), Maria Concepción Civera Tejuca (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Enzimología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • Estudios funcionales y estructurales en quinasas dependientes de ADP relacionadas con el metabolismo de glucosa en Archaea. En algunos organismos Archaeas, la vía glicolítica presenta modificaciones entre las que destaca las enzimas quinasas que fosforilan glucosa y fructosa 6-fosfato utilizando ADP, en vez de ATP, como dador de grupo fosforilo. Estas enzimas pertenecen a la superfamilia riboquinasa, puntualmente a la familia de quinasas dependientes de ADP, y están conformadas por un dominio menor y un dominio mayor el cual presenta un plegamiento tipo riboquinasa, común a todos los miembros esta superfamilia. La mayoría de estas quinasas han sido descritas en arqueas hipertermófilas como Thermococcus litoral (TlGK), y metanogénicas bifuncionales, con actividad glucoquinasa y fosfofructoquinasa, de Methanococcus jannaschii o Methanococcus maripaludis, aunque también se han encontrado en organismo eucarióticos como humano y ratones. En este trabajo de tesis se estudió la enzima glucoquinasa de TlGK como modelo de una quinasa hipertermófila dependiente de ADP y conocer los determinantes estructurales en el mecanismo cinético y la especificidad por el nucleótido de adenina a través de cristalografía de rayos ¿X y estudios cinética enzimática. Los resultados demostraron que la enzima TlGK experimenta cambios en su conformación como consecuencia de la unión de sus ligandos. Hecho que fue comprobado a partir de las estructuras de la proteína, donde se distinguió que la proteína en su forma apo (2.0 Å) presenta una mayor distancia entre sus dominios (conformación abierta), mientras que en la estructura en complejo ternario (2.5 Å) esta distancia se reduce mostrando una estructura cerrada. Estos resultados se correlacionan con el mecanismo cinético que correspondió a un mecanismo ordenado en secuencia, donde la unión de MgADP, gatilla el primer cambio en la conformación de la enzima, seguido por la unión de glucosa provocando el cierre total de los dominios de la enzima. Dichos cambios conformacionales son estabilizados por una serie de interacciones que se coordinan entre los dominios menor y mayor También se evaluó la especificidad por el nucleótido, generando una versión permutante de la TlGK (perGK) que imita la topología de la región ß-meandro, que constituye casi por completo el sitio de unión del nucleótido. Los resultados indican que la permutación no es suficiente para el cambio en la especificidad del nucleótido, lo que se confirmó midiendo la actividad de la enzima en presencia de ambos nucleótidos, ADP y ATP. Asimismo, los estudios cinéticos señalan que el mecanismo de perGK es ordenado en secuencia, no obstante, el orden de unión de los sustratos varió, respecto a lo observado para la enzima TlGK. Estos cambios fueron avalados en las estructuras cristalinas de la proteína perGK en su forma apo en conformación abierta (2.14 Å) en complejo con glucosa (1.95 Å) y el complejo ternario (2.44 Å), generadas por cristalografía de rayos-X. A partir de estas estructuras, se infiere que la enzima perGK sufre un cambio en su conformación luego que se une glucosa, no así con la unión de MgADP, en claro contraste con TlGK. Estos resultados demuestran que este cambio en la topología, posiblemente, haya sido uno de los cambios estructurales que experimentaron estas enzimas, de la superfamilia de riboquinasas, a lo largo de su historia evolutiva para transformarse a quinasas dependientes de ADP. La enzima dependiente de ADP de M. jannaschii (MjPfk/GK), que posee las dos actividades fosfofructoquinasa y glucoquinasa en la misma cadena polipeptidica, es la única enzima caracterizada de este tipo del orden de las Methanococcales, por lo que se desconoce si este carácter dual de la enzima bifuncional es un rasgo particular de MjPfk/GK, o si es una característica común de los miembros de este orden.En este estudio se determinó que el mecanismo cinético de la enzima MjPfk/GK es en secuencia para ambas reacciones, y que esta enzima solo tiene la capacidad de fosforilar glucosa y fructosa-6-fosfato, siendo por tanto muy específica de la vía glicolítica. Además, se confirmó que la enzima fosfofructoquinasa del mesófilo M. maripaludis presenta actividad glucoquinasa además de actividad fosfofructoquinasa lo que indica que este rasgo bifuncional es común a otros miembros del orden Methanococcales, y que quizá se trate de un rasgo compartido en muchas enzimas homologas. Finalmente, se dilucidó que la actividad glucoquinasa en ambas enzimas bifuncionales se ve afectada por las concentración libre de Mg2+ y por el producto de la reacción AMP, lo que nos lleva a pensar que estos metabolitos pueden ser claves para promover la vía glicolítica actuando como un sensor de la disponibilidad de energía celular aportada por ADP o ATP.