Desarrollo de métodos moleculares de detección de virus de RNA de cultivos hortícolas.

• Autores: Ezequiel Alonzo Rangel Aranguren
• Directores de la Tesis: Luis Rubio Miguélez (dir. tes.), Antonio Olmos Castelló (dir. tes.), Salvatore Davino (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Politècnica de València ( España ) en 2015
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Paloma Abad Campos (presid.), Nuria Duran-Vila (secret.), Javier Romero Cano (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Ácidos nucleicos
  • Ciencias agrarias
    • Horticultura
      • Hortalizas
    • Fitopatología
      • Virus
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RiuNet
• Resumen

  • En esta tesis doctoral ¿DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN DE VIRUS DE RNA DE CULTIVOS HORTÍCOLAS¿, se abordaron dos retos relacionados con el desarrollo de métodos moleculares de detección de ribovirus (con genoma de RNA) que afectan a cultivos hortícolas. El primero corresponde a la detección del género Fabavirus, que está compuesto por cinco especies virales: virus 1 del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 1, BBWV-1), virus 2 del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 2, BBWV-2), virus del mosaico de la genciana (Gentian mosaic virus, GeMV), virus del mosaico suave de cucurbitáceas (Curcubit mild mosaic virus, CuMMV) y virus del mosaico suave de la hortiga blanca (Lamium mild mosaic virus, LMMV). En primer lugar se secuenció el genoma completo del único aislado disponible de LMMV, ya que era la única especie viral de este género de la que no se disponía ninguna secuencia nucleotídica. La comparación de esta secuencia con la del genoma completo de los otros fabavirus confirmó que LMMV es una especie viral per se, al ajustarse a los criterios actualmente aceptados de demarcación entre géneros y especies virales. Se encontró varias repeticiones de un motivo de diez nucleotidos en las zonas no traducibles del extremo 5¿ de todos los miembros del género Fabavirus que se puede considerar como una seña de identidad y serviría para asignar nuevos virus a este género viral. En segundo lugar, a partir de todas las secuencias nucleotídicas disponibles de todos los virus del género Fabavirus se diseñó una pareja de iniciadores conservados para poder detectar por retrotranscripción (reverse transcription, RT) y PCR (RT-PCR) todos los fabavirus en una única reacción. También se diseñaron cinco parejas de iniciadores, cada una específica para una especie viral, para poder detectar e identificar cualquiera de estos virus en una única reacción mediante RT-PCR múltiple (multiplex RT-PCR). La combinación de ambos procedimientos de RT-PCR permite detectar e identificar cada una de las cinco especies conocidas del género Fabavirus, así como descubrir nuevas especies dentro de este género. En tercer lugar, se diseñó una sonda molecular correspondiente a la región del genoma que contenia las repeticiones del motivo de diez nucleótidos, con la que se pudo detectar las cinco especies del género Fabavirus mediante hibridación molecular de flujo. Esta es la primera vez que se consigue una sonda conservada para un género viral. También se diseñaron cinco sondas, cada una específica para cada una de cinco las especies conocidas del género. De manera que mediante hibridación de flujo con las seis sondas se pueden identificar BBWV-1, BBWV-2, LMMV, GeMV y CuMMV y descubrir nuevas especies dentro del género Fabavirus. Para comprobar la especificidad de las técnicas de RT-PCR e hibridación desarrolladas aquí, ambas se probaron con distintos aislados de una misma especie viral que eran genéticamente muy divergentes (identidad ~80%) y no se produjeron falsos negativos. Así mismo se constató in silico o in vitro que estas técnicas no producían falsos positivos al no detectar otros virus relacionados fuera del género Fabavirus, como son aquellos que pertenecen a los géneros Comovirus y Nepovirus, que junto el género Fabavirus forman la subfamilia Comovirinae. El otro reto que se planteó fue la detección e identificación de los siete ribovirus más importantes en los cultivos de tomate del área mediterránea y otras áreas subtropicales: virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV), virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV), virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV), virus del la clorosis del tomate (Tomato chlorosis virus, ToCV), virus de la clorosis infecciosa del tomate (Tomato infectious clorosis virus, TICV), virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV), y virus del torrado del tomate (Tomato torrado virus, ToTV). Primero se caracterizó la variabilidad genética de ToMV puesto que era el único de estos virus en la que no se había estudiado este atributo. Se encontró tres grupos de aislados que tenían entre ellos identidades nucleotídicas menores al 90%. Sin embargo, solamente uno de estos grupos se había dispersado por el mundo y se caracterizaba por una gran estabilidad y muy baja variabilidad genética (identidades mayores del 98%). A partir del análisis de todas las secuencias disponibles de estos siete virus se diseñaron siete parejas de iniciadores específicos para cada virus. Se tuvo en cuenta la variabilidad genética dentro de cada uno de los siete virus para evitar o minimizar los falsos negativos. Mediante dos RT-PCR múltiples (una para CMV, ToMV y TICV y la otra para TSWV, ToCV, ToTV y PepMV) se pudo detectar e identificar cada especie viral tanto en infecciones únicas como múltiples en muestras de campo de Sicilia con una prevalencia variable según el virus y el área geográfica. Los métodos moleculares de detección desarrollados en esta tesis permiten llevar a cabo prospecciones rutinarias en grandes áreas de cultivo, recabando información epidemiológica muy valiosa para el manejo de enfermedades a diferentes escalas geográficas, y constituyen una primera línea de defensa frente a la ocurrencia de brotes de las enfermedades virales. El desarrollo y adopción de esta metodología supone un aporte que contribuiría a mejorar la gestión de la calidad por parte de empresas productoras y distribuidoras de semillas o propágulos asexuales, y a las agencias gubernamentales reguladoras del comercio internacional de estos productos con la finalidad de disminuir los riesgos y reducir el enorme impacto económico, valorado en decenas de millones de euros anuales, en pérdidas directas e indirectas, que implica la emergencia y dispersión de los virus en las economías de los países afectados. Esta tesis presenta 299 referencia bibliográficas.