Estudi d'un receptor quinasa atípic (Mark) i de les proteïnes que interaccionen amb el seu domini intracel·lular. Transducció del senyal i desenvolupament en blat de moro (Zea mays)
- Autores: Blanca Llompart Royo
- Directores de la Tesis: Pere Puigdomènech i Rosell (dir. tes.), Josep Maria Casacuberta i Suñer (dir. tes.), Maria Lluïsa Molinas i de Ferrer (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Girona ( España ) en 2007
- Idioma: catalán
- ISBN: 978-84-690-5948-7
- Depósito Legal: Gi-325-2007
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jordi Casanova Roca (presid.), Maria Pla i de Solà-Morales (secret.), Neus Agell Jané (voc.), Jaime F. Martínez García (voc.), Francesc Posas Garriga (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
Aquesta tesi doctoral sengloba dins dun projecte general destudi de gens implicats en lembriogènesi del blat de moro. Lembriogènesi del blat de moro, i en general la de totes les plantes superiors, es dóna en tres etapes: una primera etapa on es diferencien tots els diversos teixits que formaran lembrió, una segona etapa on lembrió acumula productes de reserva i un tercer període, la dormància, que finalitza quan les condicions ambientals són les idònies per a la germinació. En el laboratori estàvem interessats, concretament, en lestudi de gens implicats en la primera etapa morfogenètica, on els diferents teixits i estructures embrionàries queden definides. Per tal destudiar gens que sexpressaven en aquest període, una de les estratègies que es va realitzar fou un crivellat diferencial entre teixit embrionari i teixit de planta adulta. Dentre els diferents clons obtinguts, un corresponia a un clon parcial que presentava similitud amb receptors quinasa i que fou objecte destudi. A partir daquest clon es va obtenir el clon complet i es va anomenar MARK (per Maize Atypical Receptor Kinase).
MARK presenta una estructura típica dun receptor quinasa amb un domini extracel.lular, que conté 6 còpies imperfectes de LRR (Leucine- Rich Repeats), un únic domini transmembrana i un domini quinasa intracel.lular. El domini quinasa de MARK presenta, però, algunes variacions en els residus aminoacídics que es consideren claus per a la funció catalítica dels dominis quinasa. En concret cinc dels aminoàcids considerats essencials per a la fosforilació es troben substituits en el domini quinasa de MARK (DK-MARK). Els experiments de fosforilació in vitro que es van realitzar al laboratori, van mostrar com MARK era incapaç de fosforilar in vitro. Aquesta característica no és, però, exclusiva de MARK. Una búsqueda en les bases de dades ens van permetre identificar altres seqüències que també presentaven els mateixos o altres canvis en aquestes posicions aminoacídiques. En les bases de dades de plantes es van identificar un conjunt de seqüències genòmiques o ESTs amb aquestes característiques i només una delles, la proteïna TMKL1 dArabidopsis, ha sigut descrita com un receptor quinasa incapaç de fosforilar in vitro. Respecte a la búsqueda de receptors similars a MARK en les bases de dades danimals, es van identificar també un conjunt de proteïnes que, en alguns casos, sha descrit que no tenen activitat quinasa in vivo. Per exemple, un dels casos més ben estudiats és el del receptor erbB3 que forma part de la família de receptors del EGF (Epidermal Growth Factor). Aquesta família de receptors està formada per 4 receptors: erbB1, erbB2, erbB3 i erbB4, dels quals només lerbB3 no presenta activitat catalítica. Sha descrit que erbB3 és capaç, tot i no fosforilar in vivo, de participar activament en la transducció del senyal formant heterodímers amb els altres membres de la família. Així, erbB3 és fosforilat pel seu partner i pot iniciar la cascada de transducció del senyal. La participació derbB3 en la transducció del senyal és essencial ja que embrions de ratolí knock-out pel gen erbB3 són inviables. Així doncs, el fet que receptors quinasa catalíticament inactius participin en les cascades de transducció del senyal, suggereix lexistència de nous mecanismes dacció per a la transducció del senyal. Per tant, lobjectiu daquest treball fou lestudi del mecanisme dacció de MARK mitjançant la caracterització les proteïnes capaces dinteraccionar amb el seu domini quinasa. Per tal dassolir aquest objectiu, es va realitzar un crivellat de doble-híbrid amb una llibreria de cDNA dembrions de blat de moro de 7 DAP. Daquest crivellat es va obtenir un conjunt de possibles clons positius que foren seqüenciats i entre els quals es van escollir per un estudi més detallat aquells que shavien obtingut més vegades com a clons independents. Aquests clons codificaven per: una SAMDC (S-Adenosil Descarboxilasa), una eIF5 (Eukaryotic translation initiation), una hypothetical protein, una unknown protein, una gamma-adaptina i una MAP4K. Amb aquests 6 clons es van fer estudis in vitro i in vivo per tal de confirmar al seva interacció amb DK-MARK. Els estudis in vivo es van realitzar amb la soca de llevat AH109, una soca més astringent que la utilitzada en el crivellat, ja que presenta tres gens marcadors: Histidina, Adenina i Lacz. Els resultats obtinguts van mostrar que els clons codificants per SAMDC i eIF5 no van créixer en un medi selectiu per His i Ade i, per tant o es tracta de falsos positius del sistema o la seva interacció amb DK-MARK és dèbil. Daltra banda, la resta dels clons analitzats (proteïna hipotètica, una proteïna de funció desconeguda, la gamma-adaptina i una MAP4K) van créixer en medis en absència de Histidina i Adenina. Els assatjos de b-galactosidasa van ser tots positius a excepció de la proteïna hipotètica suggerint que potser aquesta interacció sigui més feble. Daltra banda també es van realitzar estudis in vitro amb la tècnica del pull-down. Els resultats obtinguts amb aquesta tècnica van recolzar els obtinguts en cèl.lules de llevat, ja que tots els clons analitzats a excepció dels codificants per SAMDC i eIF5 van donar un resultat dinteracció amb KD-MARK in vitro positiu. Davant aquests resultats ens vam centrar en lestudi de la proteïna similar a MAP4K, doncs algunes proteïnes de la seva família shan relacionat amb receptors de membrana. Els clons que es va obtenir del crivellat codificaven per una proteïna similar amb el domini C-terminal a les proteïnes BnMAP4Ka1 i a2 de Brassica napus. Aquestes proteïnes presenten una forta similitud de seqüència amb proteïnes de la família GCK/SPS1 que formen part dun grup particular de MAPK relacionades amb la proteïna Ste20 (sterile 20 protein) de llevat. Ste20p activa la MAP3K de llevat Ste11 directament per fosforilació, transduint daquesta manera el senyal del receptor de feromones de creuament de les cèl.lules de llevat i es pot, doncs, considerar com una proteïna del tipus MAP4K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase). En els darrers anys, shan identificat un gran nombre de proteïnes similars a Ste20: fins a una trentena en mamífers, en Drosophila, en Caenorhabditis elegans i en altres organismes. Segons la seva estructura aminoacídica, la família Ste20 sha classificat en dues subfamílies: les proteïnes STE20/PAK (p21-activated kinases) i la subfamília GCK/SPS1 (germinal center kinases). Les dues subfamílies estan formades per proteïnes que contenen un domini quinasa i un domini regulador, però, mentre que les proteïnes PAK presenten el domini quinasa en la part C-terminal, les GCKs el presenten en la regió N terminal. Les proteïnes GCK presenten una elevada diversitat estructural en el domini regulador permetent la seva classificació en 6 subfamílies. Mitjançant la tècnica del RACE es va obtenir el clon de cDNA complet que es va anomenar MIK (MARK Interacting Kinase). Amb la tècnica del Southern blot es va poder determinar que el gen MIK és un gen de còpia única en el genoma de blat de moro. Per tal danalitzar la possible interacció entre DK-MARK i MIK, es va estudiar tant el patró dexpressió dambdós gens com el seu patró dacumulació dambdues proteïnes durant lembriogènesi del blat de moro. El patró dexpressió, analitzat per Northen blot va mostrar uns patrons coincidents al llarg de lembriogènesi des del seu inici fins als 20 DAP amb una acumulació màxima de mRNA en embrions de 15 DAP. Daltra banda per tal destudiar el patró dacumulació de la proteïna MIK així com per comparar-lo amb el de MARK, es van realitzar estudis de Westerns blot. Els resultats també van mostrar una coincidència en el temps de lacumulació de les proteïnes MARK i MIK durant lembriogènesi de blat de moro amb una major acumulació en embrions de 15 i 20 DAP. Es van dur a terme també estudis dimmunolocalitzacions sobre embrions de blat de moro de 15 DAP per tal destudiar en quins teixits sacumulaven ambdues proteïnes. Les immunolocalitzacions van mostrar una major acumulació tant de MARK com de MIK en les zones meristemàtiques i en el teixit vascular sobretot del coleòptil on saprecia una forta co-localització de MARK i MIK. Totes aquestes dades són compatibles, doncs, amb una possible interacció de les proteïnes MARK i MIK, tot i que no la demostren. Per tal de demostrar la interacció es van realitzar experiments dimmunoprecipitació in vivo a partir dextractes dembrions. Malauradament, els resultats no són clars i en aquests moments en el laboratori sestan posant a punt aquests experiments.
També es van realitzar estudis comparatius de seqüència amb diferents proteïnes de la família GCK, mostrant una major similitud amb les proteïnes de la subfamília GCK-III. La subfamília GCK-III ha estat molt poc estudiada i en formen part un conjunt de proteïnes amb funcions molt diverses des de lapoptosi, la citoquinesi o lanòxia cel.lular. Per tant, la similitud de seqüència possiblement fa referència a una conservació en el mecanisme dacció més que no pas a una conservació funcional. La possible interacció de MARK amb el domini C-terminal de MIK (el domini regulador) podria activar aquesta última iniciant una cascada de transducció del senyal en un model en el que una proteïna del tipus GCK-III faria de lligam directa entre un receptor de membrana i una cascada de senyalització intracel.lular. Aquest tipus de lligam entre un recepctor de membrana i mòduls intracel.lulars de senyalització sha descrit per a altres proteïnes GCK, si bé no directament sinó a través de proteïnes adaptadores. Daltra banda, la interacció directa de MARK, un receptor quinasa atípic que no té activitat catalítica, amb MIK suggereix un mecanisme on receptors atípics podrien interaccionar en la transducció del senyal activant la via de les MAPK.
