Asignación de nuevas funciones a la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa en E. coli

• Autores: Elaine Ferreira Melo
• Directores de la Tesis: Rosa Giménez Claudio (dir. tes.), Laura Baldoma (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2012
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Joaquim Ros Salvador (presid.), Elena Mercade Gil (secret.), Teresa Pellicer Moya (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Enzimología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • La identificación de interacciones proteína-proteína en las células resulta de gran importancia para entender los procesos biológicos a nivel molecular. Así, cada vez despierta mayor interés el estudio de las proteínas, no de manera individual sino a través de las interacciones que establecen con otras proteínas o biomoléculas ya que estas asociaciones son fundamentales para el desarrollo de las funciones celulares. En este sentido, una gran parte de este trabajo se ha dirigido a la aplicación de metodologías que permiten identificar y evaluar interacciones proteína-proteína, con la finalidad de asignar nuevas funciones a la enzima gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) en E. coli. Estudios realizados en humanos muestran que GAPDH es una proteína multifuncional, implicada en diversos procesos celulares. Las diferentes funciones dependen de su localización subcelular, estado oligomérico o interacciones con otras proteínas o ligandos. Sin embargo en bacterias, funciones alternativas a la glicólisis sólo se han descrito para la GAPDH secretada al medio extracelular por cepas patógenas y probióticas. El objetivo de este trabajo es contribuir a la identificación de nuevas funciones de GAPDH en E. coli a nivel intracelular mediante el estudio de las interacciones que establece con otras proteínas. Mediante experimentos de cross-linking in vivo seguidos de inmunoprecipitación y análisis por espectrometría de masas se han identificado varias proteínas implicadas en distintos procesos celulares. A través de ensayos de Pull-down seguidos de Western Blot se ha validado la interacción de GAPDH con EF-Tu, piruvato quinasa, triptofanasa, fosfoglicolato fosfatasa (PGPasa) y las subunidades ? y ? de la ATP sintasa. La diversidad de proteínas identificadas sugiere que GAPDH, a través de múltiples interacciones, podría estar participando o modulando procesos metabólicos, de transporte, síntesis de proteínas, obtención de energía y reparación de DNA. La implicación de GAPDH en procesos de reparación del DNA se ha evidenciado en estudios funcionales, utilizando células deficientes en esta proteína, en concreto mutantes knockout gapA o células silenciadas para la expresión del gen gapA mediante RNA antisentido. Se ha observado que estas células presentan una menor viabilidad que las control cuando son tratadas con agentes genotóxicos como bleomicina o metilmetanosulfonato. Además en el DNA genómico del mutante knockout gapA se observa un incremento en el número de centros abásicos generados de modo espontáneo. Mediante ensayos de Pull-down seguidos de Western Blot se ha evidenciado la interacción de GAPDH con proteínas que participan en los sistemas de reparación del DNA, como Endo IV del sistema de reparación por escisión de bases (BER) y SSB (single stranded DNA binding protein) implicada en los procesos de recombinación homóloga y en la respuesta SOS. Por último, las células deficientes en GAPDH (knockout y silenciadas) presentan morfología filamentosa en fase estacionaria de crecimiento, fenotipo sugerente de una inhibición de la replicación por acúmulo de mutaciones no reparadas.