Paper de la 1,25 dihidroxivitamina D3 extrarenal en larteriopatia urèmica. Efecte diferencial de lanaleg 19-nor-dihidroxivitamina D2
- Autores: Anna Cardús Figueras
- Directores de la Tesis: Elvira Fernández Giráldez (dir. tes.), José Manuel Valdivieso Revilla (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Lleida ( España ) en 2007
- Idioma: catalán
- ISBN: 978-84-690-7758-0
- Depósito Legal: L-1035-2007
- Tribunal Calificador de la Tesis: Xavier Matías-Guiu Guía (presid.), Daniel Sanchis Morales (secret.), Alberto Martínez Vea (voc.), Jordi Bover Sanjuan (voc.), Vicente Andrés García (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
- català
Larteriosclerosis és un procés caracteritzat per lengruximent i enduriment de la paret arterial, aquest procés es troba accelerat en pacients amb insuficiència renal crònica (IRC). A més a més, aquests pacients pateixen una disminució de la síntesis de 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) que comporta altres complicacions com el hiperparatïroidisme secundari (HPT2). Per aquesta raó es comú lús de 1,25(OH)2D3 en el tractament del HPT2. Lefecte de la 1,25(OH)2D3 en la calcificació de les cèl·lules de múscul llis (CMLV) està força estudiat, però el seu efecte en la proliferació no és molt clar.
Vàrem analitzar lefecte de la 1,25(OH)2D3 en la proliferació de les CMLV per incorporació de BrdU i citometria de flux. Els nostres resultats mostren que la 1,25(OH)2D3 indueix la proliferació de manera dosis depenent tant en estat quiescent com proliferatiu. Lefecte de la 1,25(OH)2D3 en la proliferació es correlaciona amb un increment de lexpressió del factor de creixement de lendoteli vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF). A més a més, inhibint lactivitat daquest factor sobserva que la proliferació induïda per 1,25(OH)2D3 es troba totalment bloquejada.
A partir daquests resultats vàrem analitzar la zona promotora del VEGF i vàrem detectar la presència de tres zones amb una seqüència molt semblant als elements de resposta de la vitamina D (VDRE) presents en els gens diana de la 1,25(OH)2D3.
A partir de lanàlisis per Immunoprecipitació de Cromatina (ChIP) detectem un VDRE en el promotor del VEGF on el receptor de la vitamina D (VDR) suneix després de tractar les CMLV amb 1,25(OH)2D3.
Després vàrem plantejar un model diferent per comparar lefecte de la 1,25(OH)2D3 i el 19-nor-1,25(OH)2D2 en el procés de proliferació i de calcificació in vitro, ex vivo i in vivo. Vàrem observar un increment de la proliferació en les CMLV, els anells dartèria aorta i en rates amb IRC tractades amb 1,25(OH)2D3, però no en els tractaments amb 19-nor-1,25(OH)2D2. També vàrem determinar lefecte que poden tenir aquests tractaments en la pressió arterial i ambdòs tractaments incrementen la tensió arterial sistòlica (TAS) de manera significativa, en canvi la 1,25(OH)2D3 no incrementa la diastòlica (TAD) de la mateixa manera que el 19-nor-1,25(OH)2D2. La pressió del pols (PP) incrementa significativament en els animals tractats amb 1,25(OH)2D3.
v Larteriosclerosis és un procés caracteritzat per lengruximent i enduriment de la paret arterial, aquest procés es troba accelerat en pacients amb insuficiència renal crònica (IRC). A més a més, aquests pacients pateixen una disminució de la síntesis de 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) que comporta altres complicacions com el hiperparatïroidisme secundari (HPT2). Per aquesta raó es comú lús de 1,25(OH)2D3 en el tractament del HPT2. Lefecte de la 1,25(OH)2D3 en la calcificació de les cèl·lules de múscul llis (CMLV) està força estudiat, però el seu efecte en la proliferació no és molt clar.
Vàrem analitzar lefecte de la 1,25(OH)2D3 en la proliferació de les CMLV per incorporació de BrdU i citometria de flux. Els nostres resultats mostren que la 1,25(OH)2D3 indueix la proliferació de manera dosis depenent tant en estat quiescent com proliferatiu. Lefecte de la 1,25(OH)2D3 en la proliferació es correlaciona amb un increment de lexpressió del factor de creixement de lendoteli vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF). A més a més, inhibint lactivitat daquest factor sobserva que la proliferació induïda per 1,25(OH)2D3 es troba totalment bloquejada.
A partir daquests resultats vàrem analitzar la zona promotora del VEGF i vàrem detectar la presència de tres zones amb una seqüència molt semblant als elements de resposta de la vitamina D (VDRE) presents en els gens diana de la 1,25(OH)2D3.
A partir de lanàlisis per Immunoprecipitació de Cromatina (ChIP) detectem un VDRE en el promotor del VEGF on el receptor de la vitamina D (VDR) suneix després de tractar les CMLV amb 1,25(OH)2D3.
Després vàrem plantejar un model diferent per comparar lefecte de la 1,25(OH)2D3 i el 19-nor-1,25(OH)2D2 en el procés de proliferació i de calcificació in vitro, ex vivo i in vivo. Vàrem observar un increment de la proliferació en les CMLV, els anells dartèria aorta i en rates amb IRC tractades amb 1,25(OH)2D3, però no en els tractaments amb 19-nor-1,25(OH)2D2. També vàrem determinar lefecte que poden tenir aquests tractaments en la pressió arterial i ambdòs tractaments incrementen la tensió arterial sistòlica (TAS) de manera significativa, en canvi la 1,25(OH)2D3 no incrementa la diastòlica (TAD) de la mateixa manera que el 19-nor-1,25(OH)2D2. La pressió del pols (PP) incrementa significativament en els animals tractats amb 1,25(OH)2D3.
Posteriorment, vàrem analitzar les diferències en la calcificació en les rates tractades amb els dos compostos i a lanalitzar el calci i el fosfat del sèrum, observem un increment significatiu de calci en els dos tractaments. Després vàrem estudiar las àrees calcificades de lartèria aorta on observem un increment clar en les rates tractades amb 1,25(OH)2D3 que no va ser observat en les rates tractades amb 19- nor-1,25(OH)2D2. També mostrem la ratio de la túnica mitja respecte el lumen i podem observar un increment significatiu en les rates tractades amb 1,25(OH)2D3.
Finalment vàrem analitzar el procés de calcificació in vitro en les CMLV on vàrem observar un clar increment del contingut de calci en aquestes cèl·lules després del tractament amb 1,25(OH)2D3, cosa que no vàrem observar en les cèl·lules tractades amb 19-nor-1,25(OH)2D2. També vàrem observar un major increment en les cèl·lules tractades amb 1,25(OH)2D3 de lexpressió de RANKL, una citoquina essencial en el procés dosteoclastogènesis secretada pels osteoblasts (en el nostre cas probablement per cèl·lules semblants a osteoblasts).
Per tant, els nostres resultats suggereixen que la 1,25(OH)2D3 estimula la proliferació mitjançant el factor de creixement VEGF y la calcificació de les CMLV.
En canvi, el 19-nor-1,25(OH)2D2 solament presenta un lleu efecte en la proliferació.
Resumen La arteriosclerosis es un proceso caracterizado por el engrosamiento y endurecimiento de la pared de las arterias. Este proceso se encuentra acelerado en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC). Además, estos pacientes sufren una disminución de la síntesis de 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) que les conduce a otras complicaciones como el hiperparatiroidismo secundario (HPT2). Por esta razón el uso de 1,25(OH)2D3 es común en el tratamiento del HPT2. El efecto de la 1,25(OH)2D3 en la calcificación de las células de músculo liso (CMLV) está bastante estudiado, pero su efecto en la proliferación no está muy claro.
Analizamos el efecto de la 1,25(OH)2D3 en la proliferación de las CMLV por incorporación de BrdU y citometría de flujo. Nuestros resultados muestran que la 1,25(OH)2D3 induce la proliferación de las CMLV de una manera dosis dependiente tanto en estado quiescente como proliferativo. El efecto de la 1,25(OH)2D3 en la proliferación se correlaciona con un incremento de expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF). Además, al inhibir la actividad de este VEGF observamos que la proliferación inducida por la 1,25(OH)2D3 se encuentra totalmente bloqueada.
A partir de estos resultados analizamos la zona promotora de VEGF y observamos la presencia de 3 zonas con secuencias muy parecidas a los elementos de respuesta de la vitamina D (VDRE) presentes en los genes diana de la 1,25(OH)2D3. A partir del análisis por Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP) detectamos un VDRE en el promotor del VEGF donde el receptor de la vitamina D (VDR) se une tras el tratamiento con 1,25(OH)2D3.
Luego planteamos un modelo distinto para comparar el efecto de la 1,25(OH)2D3 y el 19-nor-1,25(OH)2D2 en el proceso de proliferación y de calcificación in vitro, ex vivo e in vivo en un modelo de ratas IRC. Observamos un incremento de la proliferación en las CMLV, los anillos de arteria aorta y en los animales tratados con 1,25(OH)2D3 pero no en los tratamientos con 19-nor-1,25(OH)2D2. También determinamos el efecto de ambos tratamientos en la presión arterial y ambos tratamientos incrementan la TAS de manera significativa, en cambio la 1,25(OH)2D3 no aumenta la TAD de la misma manera que el 19-nor-1,25(OH)2D2. La presión del pulso incrementa significativamente en los animales tratados con 1,25(OH)2D3.
Posteriormente, analizamos las diferencias en la calcificación en ratas tratadas con los dos compuestos y al analizar el calcio y fosfato del suero observamos un incremento significativo del calcio en los dos tratamientos. También determinamos la ratio media/lumen donde podemos observar un incremento significativo en las ratas tratadas con 1,25(OH)2D3. A continuación, estudiamos las áreas calcificadas de la arteria aorta y determinamos un claro incremento en las ratas tratadas con 1,25(OH)2D3 que no es observado en las tratadas con 19-nor-1,25(OH)2D2.
Finalmente, analizamos el proceso de calcificación in vitro en las CMLV y observamos un incremento claro del contenido de calcio en estas células después del tratamiento con 1,25(OH)2D3 que no fue observado en el tratamiento con 19- nor-1,25(OH)2D2. También observamos un incremento mayor en las células tratadas con 1,25(OH)2D3 de la expresión de RANKL, una citoquina esencial en el proceso de osteoclastogénesis, secretada por los osteoblastos (en nuestro caso probablemente por células parecidas a osteoblatos).
Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la 1,25(OH)2D3 estimula la proliferación mediante el factor de crecimiento VEGF y la calcificación de las CMLV.
En cambio el 19-nor-1,25(OH)2D2v solamente presenta un leve efecto en la calcificación.
- English
Atherosclerosis is a complex process characterized by an increase in the wall thickness due to accumulation of cells and extracellular matrix between the endothelium and the smooth muscle cell wall. This process is accelerated in patients with chronic renal failure. In these patients, decreased sinthesis of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) leads to secondary complications, like hyperparathyroidism, being treatment with 1,25(OH)2D3 a common practice. The effect of 1,25(OH)2D3 on vascular smooth muscle cells (VSMC) calcification has been widely studied, but the role of 1,25(OH)2D3 on VSMC proliferation remains obscure.
We have analyzed the effects of 1,25(OH)2D3 in the proliferation of VSMC. We found that 1,25(OH)2D3 induces a dose-dependent increase in VSMC proliferation in quiescent cells and in cells stimulated to grow. The effect of 1,25(OH)2D3 on VSMC proliferation is mediated by an increase of the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), since the inhibition of VEGF activity totally blunted the 1,25(OH)2D3-induced VSMC proliferation. These results led us to study the promoter zone of VEGF gene. In this sequence we detected three putative sequences resembling vitamin D response elements (VDRE). Using chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis we determined one VDRE in VEGF promoter that binds to the vitamin D receptor (VDR) after treatment with 1,25(OH)2D3.
Then, we aimed to study the effect of 1,25(OH)2D3 and 19-nor-1,25-(OH)2D2 in VSMC proliferation and calcification in vitro, ex vivo and in vivo in a model of chronic renal failure (5/6 nephrectomy). We found an increase in proliferation in vitro, ex vivo in aortic rings incubated with 1,25(OH)2D3 and in animals treated with 1,25(OH)2D3 for 8 weeks. Furthermore, 19-nor-1,25-(OH)2D2 treatment did not increase VSMC proliferation. We determined the effect of 1,25(OH)2D3 and 19-nor- 1,25-(OH)2D2 in blood pressure. Both treatment increased SBP significantly. However 19-nor-1,25-(OH)2D2 induced a significant increase in DBP which was not seen in the 1,25(OH)2D3 treated animals. The pulse pressure increased significantly with 1,25(OH)2D3 treatment. Then, we analized calcium and phosphate serum levels in rats and we observed a significant elevation of serum calcium in both treatments.
This elevation was not different between 1,25(OH)2D3 and 19-nor-1,25-(OH)2D2. The ratio media/lumen area increased significantly in the 1,25(OH)2D3-treated group.
Finally, we studied the calcified areas and we noticed a clear increase of calcification in rats treated with 1,25(OH)2D3 compared with control and 19-nor-1,25-(OH)2D2 1,25(OH)2D3 stimulated VSMC proliferation and calcification in vivo. In contrast, 19- nor-1,25-(OH)2D2 had a slight effect in proliferation process with no effect on calcification, despite the increases in plasma calcium observed in both groups.
Finally, we evaluated the calcification proces in VSMC in vitro. Firstly, we determined calcium content in VSMC treated with 1,25(OH)2D3 or 19-nor-1,25- (OH)2D2 and we observed an increase of VSMC calcification only in cells treated wit 1,25(OH)2D3. Moreover, we analized different osteoblastic markers and we detected that RANKL expression incresased 5 fold in 1,25(OH)2D3 treatment.
Therefore, this results suggest that 1,25(OH)2D3 stimulate vascular smooth muscle cells through VEGF mediated pathway. 1,25(OH)2D3 stimulate calcification process too. Analog of vitamin D, 19-nor-1,25-(OH)2D2 only present slight efect in VSMC calcification.
- català
