Resumen de Estudio de las bases de la resistencia a las proteínas insecticidas de bacillus thuringiensis en ostrinia nubilalis
Ostrinia nubilalis (Hübner) es una de las plagas más devastadoras de los cultivos de maíz de Europa y Norte América, y a nivel económico la obtención de un control eficaz de esta plaga es un logro fundamental. En 1996, se permitió la comercialización de las plantas transgénicas que llevan insertado en el genoma un gen procedente de Bacillus thuringiensis (Berliner) (Bt) y que codifica para una proteína insecticida de las que esta bacteria produce en forma de cristales paraesporales (proteínas Cry). A partir de esta fecha, la adopción de los cultivos de maíz Bt que expresan en concreto la toxina Cry1Ab ha ido aumentando progresivamente en todo el mundo, con el resultado de que las pérdidas económicas producidas por O. nubilalis se han reducido de forma considerable. Recientemente, un nuevo evento de maíz transgénico que expresa la proteína Cry1F, también tóxica frente O. nubilalis, ha salido a la venta, aumentando el abanico de plantas Bt empleadas para el control de esta plaga. Las ventajas derivadas del empleo de las plantas Bt son muchas pero esta tecnología no está libre de amenazas: el mayor peligro reside en el potencial de los insectos diana para desarrollar resistencia a las toxinas insecticidas empleadas contra ellos. La posible aparición de resistencia se puede producir por mutaciones en cualquiera de los genes involucrados en cada uno de los pasos del mecanismo de acción de las proteínas Cry. Por esta razón, el conocimiento de las bases bioquímicas por las cuales actúan estas toxinas, así como de las bases genéticas, son esenciales para preservar a largo plazo las tecnologías fundamentadas en B. thuringiensis. Para la realización de este trabajo de investigación se planteó abordar tanto la caracterización de poblaciones españolas de O. nubilalis, estudiando el potencial de desarrollo de resistencia a la toxina Cry1Ab, como el estudio de las moléculas del epitelio intestinal que pueden estar implicadas en el mecanismo de toxicidad de las proteínas Cry en este insecto plaga. En la primera parte de esta tesis, comparamos la susceptibilidad de una población de campo procedente del sur-este de España con la de una colonia de laboratorio a cuatro proteínas Cry ensayadas tanto en forma de toxina activada como de protoxina, así como al producto estándar HD-1-S2005. La característica principal de la población de campo escogida fue su procedencia: invernaderos cultivados con pimientos, donde se utilizaban formulados Bt para el control de las plagas de lepidópteros durante toda la temporada vegetativa. Los resultados de los bioensayos de mortalidad indicaron que las proteínas más toxicas para O. nubilalis son las toxinas de la clase 1 mientras que la toxina Cry2Aa ejerce un efecto tóxico menor. Con este tipo de ensayos, encontramos diferencias significativas entre la susceptibilidad de la colonia de campo y de la colonia de laboratorio, siendo esta última más susceptible a todas las toxinas de la clase 1. Sin embargo, el conjunto de todos los resultados obtenidos en este trabajo, que incluyen también el estudio de la mortalidad funcional y un ensayo de selección en laboratorio de resistencia a la proteína Cry1Ab, apunta a que las diferencias encontradas se debían más probablemente a variación intraespecífica que a un proceso de selección de resistencia producido en el invernadero. En el segundo apartado de esta tesis, la tolerancia de O. nubilalis a la proteína Cry1Ab se estudió bajo un punto de vista genético cuantitativo. Se fundaron isolíneas derivadas del apareamiento de adultos procedentes de dos diferentes localidades españolas, y las progenies se sometieron a cribado con la proteína Cry1Ab, a una concentración que causó una mortalidad media entre todas las isolíneas del 87% (± 17% SD). Solamente aquellos individuos que pertenecían a las isolíneas que tuvieron una supervivencia mayor del 40% se utilizaron para obtener la generación siguiente, que se sometió a cribado con la misma concentración de proteína Cry1Ab. Pudimos observar una clara reducción en la mortalidad, ya que la mortalidad media entre todas las isolíneas en la generación F2 fue de 62% (± 17% SD). El límite superior para la heredabilidad (h2) de la tolerancia a la proteína Cry1Ab se calculó mediante dos métodos y se situó entre 0.82 y 0.90, indicando que buena parte de la variación fenotípica en la tolerancia a la proteína Cry1Ab dependía de diferencias genéticas. La aplicación de la ecuación de Lande confirmó que la tolerancia a Cry1Ab tenía una base poligénica, ya que era debida a, como mínimo, dos loci. La contribución del gen de la caderina (candidato por estar ligado a la resistencia en otros lepidópteros) a la tolerancia a la proteína Cry1Ab se comprobó utilizando marcadores moleculares EPIC-PCR; el estudio de la segregación alélica en las isolíneas más tolerantes indicó su posible contribución en una de las cinco isolíneas examinadas. La unión de las proteínas Cry al epitelio intestinal de lepidópteros como O. nubilalis es un mecanismo fundamental para la toxicidad. Abordamos el estudio de las diferencias entre la unión de dos proteínas de la clase 1 (Cry1Ab y Cry1F), ambas expresadas en el maíz transgénico resistente a O. nubilalis, mediante ensayos de preincubación del epitelio intestinal con las mismas toxinas, lectinas, y anticuerpo anticaderina. La unión de las proteínas Cry1Ab y Cry1F (marcadas con biotina) resultó verse afectada de forma diferente: mientras que ningún tipo de preincubación pareció afectar la unión de la toxina Cry1Ab, la unión de la toxina Cry1F disminuyó tras preincubación con las toxinas Cry1Ab y Cry1F sin marcar y con el ácido síalico. Estas diferencias apuntan a la existencia de diferentes receptores (además de unos compartidos) para estas dos toxinas. Ensayos de inmunodetección de la unión de las proteínas Cry1Ab y Cry1F indicaron que éstas unen a proteínas del epitelio intestinal de O. nubilalis de un tamaño de 150 y 75 kDa, y que solamente Cry1Ab une a una proteína de alrededor de 250 kDa. Mientras que no obtuvimos ningún resultado en la identificación de las proteínas que componían la banda de 250 kDa, las proteínas más abundantes que componían las dos bandas de 75 y 150 kDa fueron identificadas como varias isoformas de aminopeptidasas N (APN). Estas son enzimas intestinales propuestos como receptores para la unión de las proteínas Cry al epitelio intestinal en varios lepidópteros. Finalmente, las APN expresadas en el intestino de O. nubilalis se caracterizaron a nivel genético, funcional y en lo que respecta a su interacción con las proteínas Cry1Ab y Cry1F. Las secuencias codificantes para seis isoformas de APN más una aminopeptidasa sensible a puromicina (PSA) se clonaron a partir de ADNc de intestino, y se caracterizaron buscando la presencia de motivos funcionales y analizando sus relaciones filogenéticas. El patrón de expresión espacial y temporal indicó que todos los genes están expresados en el intestino de las larvas de O. nubilalis durante todo el desarrollo larvario, y que solo un transcrito (onapn8) está expresado también en los túbulos de Malpighio. El gen psa es el único en tener una expresión ubicua en todos los tejidos analizados. Cinco APN se expresaron con éxito en las células Sf21 utilizando el sistema Bac-to-Bac® basado en baculovirus. La caracterización de la actividad enzimática de cada isoforma expresada en las células Sf21 demostró que cada una de ellas es funcionalmente diferente, tanto en la afinidad a varios sustratos como por la sensibilidad a diferentes inhibidores. La interacción de las APN expresadas ex vivo con las proteínas Cry se abordó mediante ensayos de inmunohistoquímica. Este tipo de aproximación nos permitió visualizar la interacción diferencial de las APN con las toxinas Cry1Ab y Cry1F: la isoforma OnAPN1 es capaz de unir a ambas toxinas mientras que las isoformas OnAPN3a y OnAPN8 solamente unen a Cry1F. Como conclusión, este trabajo aporta resultados que se añaden a los publicados previamente y que son necesarios para evaluar el potencial de desarrollo de resistencia a las proteínas Cry en O. nubilalis. En primer lugar, la tolerancia a las proteínas Cry1Ab parece ser un rasgo común en poblaciones de campo españolas. En segundo lugar, este rasgo parece derivar del efecto conjunto de varios genes, según hemos concluido tras realizar estudios de genética cuantitativa con isolíneas fundadas con individuos de zonas geográficamente distantes de España. Adicionalmente, se ha analizado la interacción de las proteínas Cry1Ab y Cry1F con el epitelio intestinal de O. nubilalis, encontrando diferencias de especificidad en la unión de estas proteínas e identificando a las APN como posibles receptores. Se han caracterizado las secuencias de los transcritos de seis isoformas de APN, y cinco han sido expresados en cultivo celular para determinar su actividad biológica y su interacción con las proteínas Cry. Los resultados indican que, de las APN estudiadas, las que podrían jugar un papel en la unión de las proteínas Cry al epitelio intestinal son tres. Además, según hemos evidenciado, estas proteínas parecen interactuar de forma diferencial con las toxinas Cry1Ab y Cry1F. Las resultados obtenidos a lo largo de esta tesis complementan los datos existentes en la literatura y esencialmente son útiles para el diseño de estrategias eficaces de manejo de la resistencia a las tecnologías Bt utilizadas a día de hoy en el control de O. nubilalis.
