El papel del colesterol en la funcionalidad de los lipid rafts y su repercusión en la adipogénesis
- Autores: Jana Sánchez Wandelmer
- Directores de la Tesis: Miguel Ángel Lasunción Ripa (dir. tes.), Rebeca Busto Durán (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Eduardo Arilla Ferreiro (presid.), Irene de los Dolores Román Curto (secret.), Emilio Herrera Castillón (voc.), Diego Gómez-Coronado Cáceres (voc.), Lisardo Boscá (voc.)
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- Resumen
- español
El colesterol es un componente esencial de las membranas de mamíferos y, además, está implicado en multitud de procesos,celulares, entre ellos la proliferación. Su deficiencia impide la progresión del ciclo celular y, en determinados tipos celulares, como las células promielocíticas HL-60, esto conduce a su diferenciación hacia granulocitos. En el presente trabajo hemos estudiado el efecto de la deficiencia experimental de colesterol sobre la diferenciación de los preadipocitos 3T3-L1 a adipocitos inducida hormonalmente. Distintos inhibidores de la biosíntesis de colesterol produjeron una fuerte disminución de la acumulación de gotas lipídicas en esas células, efecto que estaba acompañado de una reducción de la expresión de diversos factores de transcripción implicados en el proceso de adipogénesis (PPARγ, C/EBPα y LXRα) y de proteínas específicas de adipocitos maduros, como adipsina y aP2. Para establecer las causas, analizamos en primer lugar la fase de expansión clonal, que es esencial en este proceso y precede la expresión de genes que dirigen este programa de diferenciación. Observamos que las células 3T3-L1, una vez estimuladas, procedían a una división celular, proceso que no se vió afectado por la presencia de los inhibidores de la colesterogénesis. Examinamos a continuación determinadas vías de señalización implicadas en la diferenciación, observando que la inhibición de la biosíntesis de colesterol afectaba la fosforilación de las quinasas ERK1/2, p38 MAPK y Akt. Sin embargo, entre ellas, únicamente la vía de ERK1/2 parecía ser relevante para la continuidad de la diferenciación, en cuanto su inhibición se tradujo en una menor fosforilación del factor C/EBPβ, requisito indispensable para que éste se una al DNA y active la expresión de sus genes diana, entre ellos algunos de los factores de transcripción cuya expresión hemos visto disminuida. La alteración de la vía de ERK1/2 y, en consecuencia, de la fosforilación de C/EBPβ, por tanto, parece ser el mecanismo por el que la falta de colesterol bloquea la diferenciación de las células 3T3-L1 a adipocitos. En los “lipid rafts”, regiones de la membrana ricas en colesterol, se concentran multitud de moléculas de señalización. Otros autores demostraron que la desestructuración de estos microdominios por la extracción del colesterol de la membrana con ciclodextrinas, altera la señalización mediada por insulina así como la diferenciación de las células 3T3-L1. Nosotros estudiamos los efectos de distintos inhibidores de la colesterogénesis y observamos que todos ellos producían un descenso en los niveles de colesterol en estos microdominios, así como una acumulación de distintos intermediarios de la colesterogénesis, cambios que provocaban, a su vez, una deslocalización de los componentes característicos de los “lipid rafts”, como la caveolina1 y el gangliósido GM1. Esta desestructuración de los “lipid rafts” se acompañó de la pérdida de funcionalidad del receptor de insulina, inhibiéndose la señalización que desencadena. Puesto que la insulina es uno de los estímulos adipogénicos, proponemos que la alteración en la estructura y funcionalidad de los “lipid rafts” por la inhibición de la colesterogénesis, afecta las vías de señalización implicadas en la adipogénesis impidiendo, en consecuencia, la diferenciación de las células 3T3-L1 a adipocitos. El haloperidol, un antipsicótico típico ampliamente utilizado, es una sustancia anfifílica de la que se conocía que inhibía la síntesis de ergosterol en levaduras. En el presente trabajo hemos demostrado que en células de mamífero, el haloperidol inhibe distintas enzimas de la biosíntesis del colesterol (∆7 -reductasa > ∆8,7-isomerasa > ∆14-reductasa, en este orden de actividad) y la salida del colesterol libre derivado de las LDL desde los lisosomas hacia el citoplasma, afectando gravemente la homeostasis intracelular del colesterol. Ante estos hallazgos y dada la presencia de receptores de insulina y de somatostatina en los “lipid rafts”, decidimos estudiar sus efectos en células de neuroblastoma SH-SY5Y. El tratamiento con haloperidol alteró la formación de los “lipid rafts” y, consecuentemente, la señalización mediada por la insulina y por la somatostatina. Estos efectos pueden ayudar a comprender los efectos secundarios que, en ocasiones, el tratamiento prolongado con haloperidol produce en la actividad motora y la sensibilidad a la insulina. Por último, hemos estudiado el efecto del colesterol sobre la expresión de la ciclina B1, proteína que modula la actividad de la Cdk1 y controla la transición entre las fases G2 y M en el ciclo celular. El análisis de la secuencia y de la actividad transcripcional del promotor completo y de distintas deleciones reveló la presencia de un posible elemento de respuesta a USF, localizado a -77 pb antes del inicio de la transcripción en el promotor de la ciclina B1, que parece ser el responsable de los cambios de actividad del promotor ante variaciones en los niveles celulares de colesterol, por cuanto su mutación anula esta respuesta. Esta es la primera vez que se describe un elemento en el promotor de una ciclina con potencialidad de responder al colesterol.
- English
Cholesterol is an essential component of plasma membranes and is involved in important processes in mammal cells, such as cell proliferation. Actually, cholesterol deficiency has been shown to arrest the cell cycle. In promyelocytic HL-60 cells, cholesterol starvation has been shown to induce differentiation into neutrophyles. In the present work we studied the effects of cholesterol starvation on hormonally-induced differentiation of 3T3-L1 preadipocytes into mature adypocytes. We have found that treatment with different cholesterol biosynthesis inhibitors results in the reduction of lipid droplet formation and the inhibition of the expression of several transcription factors involved in adipogenesis (PPARγ, C/EBPα and LXRα) as well as adipsin and aP2, proteins that are characteristic of mature adipocytes. In order to elucidate the mechanisms involved, we firstly explored the clonal expansion, a process that is essential for the correct development of adipogenesis and precedes the expression of genes that regulate differentiation. We found that, once stimulated, 3T3-L1 cells underwent one round of cell division, independently they were treated with cholesterol biosynthesis inhibitors or not. Treatment with these inhibitors, however, resulted in the inhibition of both ERK1/2, p38 MAPK and Akt. The Inhibition of ERK1/2 apparently was the most relevant for the cessation of the differentiation process, as it resulted in the inhibition of the phosphorylation of C/EBPβ, a factor that governs the expression of several transcription factors involved in adipogenesis, which were found to be depressed by cholesterol biosynthesis inhibition. Therefore, the inhibition of C/EBPβ phosphorylation appears to be the mechanism by which cholesterol starvation inhibits experimental adipogenesis. Lipid rafts are cholesterol-rich membrane microdomains in which many receptors and acceptor molecules reside. Previous studies by others showed that membrane cholesterol extraction by means of cyclodextrins results in the destabilization of lipid rafts, and ultimately affecting both insulin-mediated signaling and 3T3-L1 differentiation. In our approach, inhibition of cholesterol biosynthesis resulted in a decrease of the cholesterol content in membranes, and the accumulation of different precholesterol sterols, depending on which enzyme was blocked. These changes in sterol composition resulted in the disruption of lipid rafts, with the lost of caveolin-1 and GM1 ganglioside, which ultimately affected the insulin-receptor signaling. This mechanism may be involved the inhibition of adipogenesis produced by cholesterol starvation. Haloperidol, a widely used antipsychotic, was reported to inhibit ergosterol synthesis in yeasts. We herein demonstrate that in mammal cells this drug inhibit different enzymes involved in cholesterol biosynthesis (∆7 -reductase > ∆8,7-isomerase > ∆14-reductase, in that order), as well as the egress of LDL-derived free cholesterol from the late endosome/lysosome compartment, thereby greatly affecting the intracellular cholesterol homeostasis. Based on these findings and considering that lipid rafts from neuronal cells have been shown to harbour both insulin and somatostatin receptors, we decided to study the effects of haloperidol in SH-SY5Y neuroblastoma cells in vitro. Treatment with this drug profoundly modified the sterol composition and disrupted lipid-raft structure, which was accompanied by the alteration of both insulin and somatostatin signalling. These effects may help in the understanding of the side effects that prolonged haloperidol treatment occasionally produces, which affect both motor activity and insulin sensitivity. Previous studies in our laboratory showed that cholesterol deprivation results in cell cycle arrest at G2/M phase and that cholesterol provision rapidly induces the expression of cyclin B1 at both mRNA and protein levels. In the present work we sought to study the mechanism involved in this action of cholesterol. By using different constructions of the human cyclin-B1 promoter we found that the region conferring the ability to respond to cholesterol was near the start of transcription point. We then identified a new possible response element for the USF factor located 77 pb upstream the transcription start site in the cyclin B1 promoter, whose mutation abolished this response. This is the first time an element on a cyclin promoter is described with the potentiality to respond to changes in the intracellular cholesterol content.
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