Lupus eritematoso sistémico en ratones MRL lpr/lpm y knockouts del receptor de quimioquina CCR2
- Autores: Natalia Camarasa Lillo
- Directores de la Tesis: Guillermo Pérez de Lema Holweg (dir. tes.), Esther Rosello Sastre (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jerónimo Forteza Vila (presid.), Mónica García-Cosío Piqueras (secret.), Julia Blanco González (voc.), Francisco Rivera Hernández (voc.), Luis Pallardó Mateu (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: e_Buah
- Resumen
- español
INTRODUCCIÓN: El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune cuya principal manifestación y debut de la enfermedad es la glomerulonefritis mediada por complejos inmunes. Los ratones MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) llevan una mutación en el gen Fas de la apoptosis que da lugar a una proliferación de linfocitos autoreactivos y son considerados un modelo de ratón que reproduce muy bien la enfermedad lúpica en el humano, con linfadenopatía asociada a proliferación aberrante de células T, esplenomegalia, y con hipergammaglobulinemia con anticuerpos anti-ADN que se depositan y dañan diversos órganos, incluyendo riñón. Este daño está provocado por el depósito de complejos inmunes, la activación del complemento y por el infiltrado inflamatorio leucocitario. El infiltrado inflamatorio renal consiste principalmente en linfocitos T y macrófagos, que son los máximos contribuyentes al desarrollo y progresión de la insuficiencia renal terminal, que finalmente desencadena el fallecimiento de los ratones MRL/lpr. Es conocido que los niveles de mARN del receptor de quimioquina CCR2 se incrementa en los riñones de esta cepa de ratones. Numerosos estudios tanto en humanos como en ratones lúpicos experimentales han dado evidencia de que las quimioquinas desempeñan un papel considerable durante el desarrollo y progresión de la enfermedad renal. Entre las quimioquinas mejor estudiadas y sus respectivos receptores están CCL2 y su receptor CCR2 para monocito-macrófagos y células T, así como CCL5 y sus receptores CCR1 y CCR5. CCR2 y su ligando CCL2 parecen tener un papel tanto en la respuesta inmune general como en el infiltrado inflamatorio local intrarrenal de los ratones lúpicos. En este estudio, examinamos el desarrollo y progresión de la enfermedad lúpica, especialmente la nefritis, en ratones MRL/lpr, a través de la generación de ratones knockout para CCR2 que se cruzaron durante 7 generaciones con ratones MRL/lpr.
MATERIAL Y MÉTODO: Se utilizaron cortes de 4 æm de grosor del tejido renal en parafina, que se tiñeron rutinariamente con Hematoxilina&Eosina, Periodic acid-Schiff (PAS) y Plata Metenamina. Un patólogo, de forma ciega, evaluó las lesiones histopatológicas de los riñones y de otros órganos estudiados (ganglio linfático, bazo, glándula salival y pulmón). Las lesiones glomerulares se gradaron semicuantitativamente de 0 a 3 para la hipercelularidad glomerular, la expansión de la matriz mesangial y la necrosis (0: ausencia, 1: leve, 2: moderado, 3: grave) y para la presencia de semilunas (0: menos del 10%, 1: 10-25%, 2: 25-40%, 3 más del 40%). La puntuación glomerular se obtuvo del sumatorio de cada parámetro evaluado. Las lesiones túbulo-intersticiales también se gradaron de 0 a 3 (0: ausencia, 3: máxima intensidad) para el infiltrado celular peritubular y pericapilar, para el daño tubular y para la fibrosis intersticial, y de 0 a 1 (0: ausencia, 1: presencia) para la vasculitis. Se obtuvo una puntuación túbulo-intersticial global del sumatorio de todos los parámetros. Se caracterizaron y cuantificaron en el tejido renal las células positivas para CD3, ER-HR3 y Ki67. Las células se cuantificaron en 20 glomérulos o en 10 campos de gran aumento (630X) en el compartimento túbulo-intersticial y expresado células por glomérulo o por campo de gran aumento. Los estudios de inmunofluorescencia directa se realizaron usando anticuerpos anti-Ig G y anti-IgM de conejo anti-ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anticuerpo anti-C3 de cabra anti-ratón marcado con FITC. Se realizaron también secciones en parafina de otros tejidos (pulmón, glándula salival, ganglio linfático y bazo) y tinciones con H&E, PAS y Plata Metenamina. El infiltrado leucocitario se gradó de 0 (mínima intensidad) a 3 (máxima intensidad).
RESULTADOS Y CONCLUSIONES; Los ratones MRL/lpr deficientes en CCR2 desarrollaron menos linfadenopatía, tuvieron menos proteinuria, menor puntuación histológica renal y menor infiltrado inflamatorio por células T y macrófagos en los compartimentoss glomerular y túbulo-intersticial, a pesar de similares niveles de inmunonoglobulinas circulantes y similares depósitos de complejos inmunes en el glomérulo tanto en los ratones deficientes en CCR2 como en los no deficientes. Los niveles de anticuerpos anti-ds-ADN, se redujeron en los ratones con ausencia de CCR2. La frecuencia de células T CD8+ en sangre periférica fue significativamente inferior en los ratones deficientes en CCR2. Así pues, la deficiencia de CCR2 no sólo influencia en el infiltrado de monocito/macrófagos y el infiltrado de células T en el riñón, sino también en la respuesta sistémica de células T en los ratones MRL/lpr. Estos datos sugieren un importante papel de CCR2 tanto en el desarrollo general de la autoinmunidad como en la afectación renal de la enfermedad lúpica. CCR2 podría ser una importante diana terapéutica para el tratamiento de la nefritis lúpica.
- English
INTRODUCTION: Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disease with immune-complex mediated glomerulonephritis as a major manifestation and determinant of the disease outcome. The MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) mouse carries a mutation in the apoptosis-related Fas gene resulting in autoreactive lymphocyte proliferation and is considered as a mouse model closely mimicking the human disease with lymphadenopathy associated with proliferation of aberrant T cells, splenomegaly, hypergammaglobulinemia with anti DNA-antibodies leading to tissue deposition and injury in various organs, including lung and kidney. The latter are mediated by immune-Complex deposition, complement activation and infiltration of inflammatory leukocytes. The renal leukocyte infiltrates consist mostly of T cells and monocytes and are major contributors to the development of progressive renal insufficiency ultimately resulting in the demise of the MRL-Fas-lpr mice. It was reported previously that steady-state mRNA levels for the chemokine (C-C motif) receptor 2 (CCR2) continuously increase in kidneys of MRL/lpr mice. Numerous studies in both human and experimental murine lupus have provided evidence that chemokines play a considerable role during the development and progression of the renal disease. Among the best studied chemokines and their respective receptors under those conditions are MCP-1 (CCL2) and its receptor CCR2 for monocytemacrophages and T cells as well as RANTES (CCL5) and its receptors CCR1 and CCR5. As CCR2 bearing mononuclear cell types appears to play a role in both the general immune response as well as the local intrarenal leukocyte infiltration in lupus mice we examined the development and progression of the disease and especially the nephritis in MRL-Fas-lpr mice by generating a CCR2 knockout mouse and backcrossing it for seven generations into the MRL-Fas-lpr background. The CCR2 receptor and CCL2 are considered to not only play a role in the local infiltration of monocyte-macrophages and T cells, but also in the general immune response as demonstrated in CCR2 and in part also in CCL2 knockout mice.
METHODS: Sections of 4 µm thickness from paraffin-embedded renal tissue were routinely stained with hematoxylin/eosin (H&E), periodic acidSchiff (PAS) and silver methenamine stains. A renal pathologist blinded for the treatment performed the histopathological. Glomerular lesions were semi-quantitatively graded from 0 to 3+ for hypercellularity, mesangial matrix expansion and necrosis (0: absence, 1: mild, 2: moderate, 3: severe), as well as for the percentage of sclerotic glomeruli and presence of crescents (0: less than 10%, 1: 10-25%, 2: 25-40%, 3 more than 40%). A glomerular score was obtained from the sum of each parameter. Tubulointerstitial lesions were also graded from 0 to 3+ for peritubular and pericapillar mononuclear cell infiltrate, tubular damage, interstitial fibrosis and vasculitis. A tubulointersitial score was also defined as the sum of all parameter. Finally, perivascular lymphoproliferative mononuclear cell infiltrate was graded from 0 (absence) to 3+ (maximal intensity).
CD3, ER-HR3 and Ki67-positive cells were characterised and quantified on 4-µm-thick paraffin sections from renal tissue. For quantification, positively stained cells were counted within 20 glomeruli or within 10 high power fields (630x) of tubulointerstitial tissue from 4 independent mice per group and expressed as cells per glomerulus or high power field. Direct immunofluorescence studies were performed on 5 µm, ether/ethanol-fixed, cryostat sections by using FITC-conjugated rabbit anti-mouse IgG and IgM antibody and goat anti mouse complement C3. Parafin sections (4 µm) from other tissues (lung, salivary gland, lymph node and spleen) were stained with H&E, PAS and silver methenamine stains and evaluated by light microscope. Leucocyte infiltration was determined and graded from 0 (minimal intensity) to 3+ (maximal intensity).
RESULTS AND CONCLUSIONS: CCR2-deficient MRL/lpr mice developed less lymphadenopaty, had less proteinuria, had reduced lesion score, and had less infiltration by T cells and macrophages in the glomerular and tubulointersticial compartment, despite similar levels of circulating immunoglobulins and similar immune complex depositios in the glomeruli of both groups. Anti ds-DNA antibody levels, were reduced in the absence of CCR2. The frecuency of CD8+ T cells in peripheral blood was significantly lower in CCR2-deficient MRL/lpr mice. Thus CCR2 deficiency influenced not only monocyte/macrophage and T cell infiltration in the kidney but also the systemic T cell response in MRL/lpr mice. These data suggest an important role for CCR2 both in the general development of autoimmunity and in the renal involment of the lupus-like disease. These results identify CCR2 as an additional possible target for the treatment of lupus nephritis.
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