Regulació d'Osterix, un gen clau per a la diferenciació osteoblàstica induïda per BMP-2

• Autores: Arnau Ulsamer Riera
• Directores de la Tesis: Francesc Ventura Pujol (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2009
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ramón Bartrons Bach (presid.), Susana Balcells Comas (secret.), Mireia Duñach i Masjuan (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • L'osteogènesi és un procés del desenvolupament dels vertebrats controlat per molècules senyalitzadores que proporcionen a les cèl·lules mesenquimals la informació necessària per a diferenciar al llinatge osteogènic.D´entre aquestes, les citoquines de la família BMP (Bone Morphogenetic Protein) estan implicades en nombrosos aspectes del desenvolupament sent especialment importants en el desenvolupament de l'os. La unió d'aquestes BMPs als seus receptors inicia diferents vies de transducció de senyal que es classifiquen com a dependents o independents de Smads. S'ha comprovat en cultius cel·lulars com les BMP estimulen l'expressió de factors de transcripció específics d'osteoblasts com són Runx2 i Osterix, així com marcadors de la diferenciació osteoblàstica com la Fosfatasa Alcalina, el Col·lagen tipus I o l'Osteocalcina.Els objectius que ens vam platejar foren:- Identificació de les vies de transducció de senyals induïdes per BMP-2 ialtres mecanismes moleculars involucrats en l'activació d'Osterix.a) Anàlisi de la regió promotora d'osterix i identificació de les regions de resposta a BMP-2.b) Identificació dels factors de transcripció que s'uneixen a aquestes regions i estudi de la seva regulació en resposta a BMP-2.-Establiment de clons estables induïbles que ens permetin estudiar in vivo la regulació transcripcional d'Osterix.-Estudi d'altres gens modulats transcripcionalment per BMP-2 i la seva implicació en l'osteogènesi.El primer pas de la recerca fou aïllar dues seqüències del promotor d'osterix que es troben molt conservades entre humans i ratolins i clonar-les en un vector pGL2 que codifica per un gen reporter luciferasa. Mitjançant la transfecció i la deleció d'aquestes construccions vam observar una seqüència de 55 parells de bases a la regió més proximal que és la responsable de la resposta a BMP-2.Mitjançant mutagènesi vam identificar una seqüència homeobox palindròmica (TAATTA) que és la responsable de la inducció d'osterix per BMP-2. La proteïna Dlx5, un factor de transcripció involucrat en l'osteogènesi, és capaç d'unir-se i activar el promotor d'osterix en aquesta seqüència. Aquesta observació es complementà amb estudis del patró d'expressió temporal d'aquests gens en que es comprovà que l'activació de Dlx5 per BMP-2 precedeix temporalment a la d'Osterix. Mitjançant experiments de sobreexpressió i silenciació en cèl·lules C2C12 descrivim que Dlx5 és imprescindible per a l'expressió d'Osterix en resposta a BMP-2. No obstant, els experiments de sobreexpressió també indicaven que la BMP-2 té un efecte additiu a Dlx5 que ens permeté deduir que algun altre mecanisme havia d'estar implicat en l'activació d'Osterix per BMP-2.Descartada una possible interacció de Dlx5 amb les proteïnes Smad, vam investigar les vies independents de Smads i observàrem que la proteïna p38-MAPK, que també és activada en resposta a BMP-2, és important per a l'activació d'Osterix induïda per BMP-2. Usant una variant constitutivament activa de MKK6, capaç d'activar p38, i SB203580, que és un inhibidor específic d'aquesta via, vam confirmar la fosforilació de Dlx5 per acció de p38 i que aquesta és funcional. Per tal de confirmar aquestes observacions sobre el promotor del gen osterix endogen, es realitzaren experiments d'immunoprecipitació de cromatina (ChIP) que confirmaren la unió de Dlx5 al promotor d'osterix in vivo que s´incrementa en presència de MKK6 constitutivament activa. També vam observar l'acetilació de la histona H3 en presència de Dlx5 i el paper sinèrgic de l'activitat histona actetil-transferasa de la proteïna p300.Així doncs, descrivim que Dlx5 integra les vies dependents i independents de Smad en la regulació d'Osterix. A més d'aquests resultats, s'ha estudiat el paper de Msx2 i p53 en la repressió de l'expressió d'Osterix i s'ha identificat un nou gen reprimit per BMP-2 que sembla estar implicat en la regulació del patró d'expressió d'aquest gen.