Síntesi, caracterització química i estudi de lactivitat biològica de nous complexos de Pt(II) amb lligands de tipus diaminocarboxílic i els respectius ésters i derivats peptídics

• Autores: Sílvia Moradell Rabert
• Directores de la Tesis: Mª de los Ángeles Martínez Lorente (dir. tes.), Antoni Llobet Dalmases (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Girona ( España ) en 2004
• Idioma: catalán
• ISBN: 84-688-9869-4
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jan Reedjik (presid.), Virtudes Moreno Martínez (secret.), Francesc Xavier Avilés Puigvert (voc.), Néstor Eduardo Katz (voc.), Jordi Bacardit Peñarroya (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen
  • català

    El cisplatí, PtCl2(NH3)2, ha estat una de les drogues més utilitzades en la quimioteràpia del càncer des del descobriment de la seva activitat. Però degut a la seva alta toxicitat i greus efectes secundaris, shan sintetitzat nous compostos amb la finalitat de reduir aquests inconvenients.

    En aquest sentit, el treball desenvolupat en aquesta tesi doctoral ha estat la síntesi i caracterització de tretze complexos de Pt(II) amb la finalitat destudiar llur activitat antitumoral. Aquests complexos presenten unes característiques estructurals comunes: geometria cis, dos lligands làbils de tipus clorur i un lligand diaminoquelatant derivat dels àcids d,l-2,3-diaminopropiònic (Hdap) i d,l-2,4-diaminobutíric (Hdab). Shan dissenyat unes estratègies sintètiques a partir de les quals els lligands han estat funcionalitzats amb diferents grups de tipus éster, aminoàcid i peptídic: Etdap2HCl, Etdab2HCl, [(dap-Metala)2CF3COOH], [(dab-Metala)2CF3COOH], [(dap-phe)2CF3COOH], [(dab-phe)2CF3COOH], [(dap-Mettrp)2CF3COOH], [(dab-Mettrp)2CF3COOH], [(dap-ASTTTNYT-NH2)2CF3COOH], essent Metala= éster metílic de L-alanina, phe= L-fenilalanina, Mettrp= éster metílic del L-triptofà. Aquests lligands diaminoquelatants shan utilitzat per sintetitzar els corresponents complexos de Pt(II): PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dab-phe), PtCl2(dap-Mettrp), PtCl2(dab-Mettrp), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2).

    A través de diferents tècniques i assaigs biològics (dicroisme circular, electroforesi en gel dagarosa, microscopia de forces atòmiques, citometria de flux, assaigs de proliferació cellular) sha pogut demostrar lactivitat antitumoral daquests compostos.

    A través de la tècnica de dicroisme circular (DC) sha pogut demostrar que els lligands lliures no interaccionen covalentment amb el DNA de Calf Thymus i no modifiquen lestructura secundària de la doble hèlix. En canvi, els respectius complexos han demostrat tenir capacitat per interaccionar amb el DNA i modificar la seva estructura secundària. Els complexos PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab) i PtCl2(dab-phe) mostren un comportament similar al cisplatí, generant adductes cis-bifuncionals que distorcionen la doble hèlix de forma no desnaturalitzant amb obertura de la doble cadena. Els complexos PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) quan interaccionen amb el DNA generen un canvi en la conformació del DNA de la forma B a la forma C, produint-se un augment de la curvatura de lhèlix per rotació de les bases nitrogenades. En aquests estudis sha comprovat que lestructura del complex influeix en lefecte generat sobre lestructura secundària de làcid nucleic. En primer lloc, existeix una diferència en el comportament en funció del tamany del lligand diaminoquelatant, de manera que els complexos amb el lligand (dab) provoquen un efecte més remarcable. També sobserva aquest canvi de comportament al passar dels complexos que tenen el grup funcional esterificat als que el tenen protonat. Daquesta manera, sobserva un major efecte sobre lestructura secundària del DNA en aquells complexos que tenen el lligand diaminoquelatant de tres metilens (dab) i amb el grup carboxilat terminal protonat.

    Per tal de modelitzar la interacció daquests complexos amb el DNA, sha estudiat la interacció daquests compostos de Pt(II) amb 5-GMP a través de RMN-1H, observant la variació dels senyals corresponents al H8 de 5-GMP. Així sha pogut demostrar que aquests compostos interaccionen amb la 5-GMP a través dun enllaç covalent Pt-N7, de la mateixa manera a com interacciona el cisplatí.

    A través delectroforesi en gel dagarosa i microscopia de forces atòmiques (AFM) sha pogut determinar lefecte que generen els lligands lliures i els respectius complexos de Pt(II) sobre lestructura terciària del plasmidi pBR322. Els lligands provoquen un augment de lagregació de les molècules de DNA i un lleuger augment de la compactació de lestructura terciària. Aquests resultats satribueixen a la capacitat daquests compostos a interaccionar per pont dhidrogen amb el DNA. Els corresponents complexos de Pt(II) provoquen un augment de lagregació i una important compactació, degut per una banda a la capacitat de làtom de Pt a interaccionar covalentment amb el DNA, i per altra banda, a la capacitat del lligand a interaccionar per pont dhidrogen amb làcid nucleic.

    Finalment sha estudiat lactivitat citotòxica daquests complexos de Pt(II) en diferents línies cellulars: A431 (línia de carcinoma epidermoide), HeLa (línia de carcinoma de coll dúter) i HL-60 (línia promielocítica de leucèmia).

    Els complexos moderadament solubles en aigua, PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe) i PtCl2(dab-phe), han demostrat ser actius. Lactivitat depèn de la concentració de complex, del temps dincubació i de la línia cellular. Per temps dincubació alts i concentracions de complex elevades sobserva la màxima activitat. Els complexos de lalanina, PtCl2(dap-ala) i PtCl2(dab-ala), són els que mostren més activitat, mentre que els compostos de la fenilalanina són els menys actius, degut probablement a la voluminositat del lligand, la qual pot impedir o dificultar el transport del compost a través de la membrana cellular.

    Lactivitat citotòxica dels complexos insolubles en aigua, PtCl2(Etdap) i PtCl2(Etdab), queda bloquejada per lelevada concentració de DMSO (12%) necessària per solubilitzar els compostos. Aquests resultats permeten deduir que la presència dun 12% de DMSO anulla lactivitat daquests complexos, ja que el DMSO pot coordinar-se amb el Pt ocupant les posicions làbils del complex i evitant que es pugui coordinar amb el DNA.

    Els assaigs de proliferació cellular del complex PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) i del pèptid lliure ASTTTNYT-NH2 han demostrat que ambdós compostos són actius. Tot i això, lactivitat del complex és superior a la del pèptid lliure, ja que el Pt pot interaccionar covalentment amb el DNA i augmentar lefecte citotòxic. Per tant, el complex presenta un lligand portador biològicament actiu que pot transportar el metall a través de la membrana cellular i facilitar així la seva interacció amb el DNA.

    A través de la tècnica de citometria de flux sha comprovat que en tots els casos la mort cellular produïda pels complexos ha estat per apoptosi.

    Per últim, sha sintetitzat i caracteritzat un complex trinuclear de Pt(II), {[Pt(Me2Bpy)2][PtCl2(Me2Bpy)]2}, essent Me2Bpy= 4,4-dimetil-2,2-dipiridil. La resolució de la seva estructura per difracció de Raig-X ha permès determinar lexistència duna interacció intramolecular Pt-Pt de 3.474 Å.

  • English

    Cisplatin, PtCl2(NH3)2, has been one of the most used drugs for the cancer chemotherapy. However, due to its high toxicity and important side effects, new complexes have been synthesized in order to reduce these disadvantages.

    In that way, the work presented in this thesis is the synthesis and characterization of 13 Pt(II) complexes in order to study their antitumor activity. These complexes present some common traits: cis geometry, two labile chloride ligands, and one diamine chelating ligand derived from d,l-2,3-diaminopropionic acid (Hdap) and d,l-2,4-diaminobutyric acid (Hdab). These ligands have been derived using new synthetic strategies with different functional groups as ester, aminoacid and peptide type: Etdap2HCl, Etdab2HCl, [(dap-Metala)2CF3COOH], [(dab-Metala)2CF3COOH], [(dap-phe)2CF3COOH], [(dab-phe)2CF3COOH], [(dap-Mettrp)2CF3COOH], [(dab-Mettrp)2CF3COOH], [(dap-ASTTTNYT-NH2)2CF3COOH], being Metala= methyl ester of L-alanine, phe= L-phenylalanine and Mettrp= methyl ester of L-triptophan. These ligands have been used for preparing the following Pt(II) complexes: PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dab-phe), PtCl2(dap-Mettrp), PtCl2(dab-Mettrp), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2).

    Using different techniques and biologic assays (circular dichroism, agarose gel electrophoresis, atomic force microscopy, flow cytometry, cell proliferation assays) the antitumor activity of these complexes has been demonstrated.

    With circular dichroism it has been demonstrated that free ligands do not covalently bind Calf Thymus-DNA and do not modify its secondary structure. In constrast, the corresponding Pt(II) complexes are able to interact with DNA and modify its secondary structure. Complexes PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab) and PtCl2(dab-phe) behave in the same direction as cisplatin, forming cis-bifunctional intrastrand adducts that probably open the double helix. The other complexes, PtCl2(Etdap), PtCl2(Etdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-Metala), PtCl2(dab-Metala), PtCl2(dap-phe), PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2), interact with DNA generating a B?C transformation with increasing winding of the double helix by rotation of the bases. The influence of the complex structure in the effect on the secondary structure of DNA has been proved. Firstly, a difference in the behaviour exists depending on the ring size, so complexes with (dab) ligand cause bigger modifications. This kind of behaviour is also seen between complexes with ester groups at the C-terminus and complexes with carboxylic group. Thus, there is a greater effect in the secondary structure of the DNA in those complexes that have the (dab) ligand and a protonated carboxylate group.

    The interaction between the platinum complexes and 5-GMP has been studied by 1H-NMR, following the variation of H8 signals from 5-GMP. It has been demonstrated that all complexes covalently interact with 5-GMP through the N7 of the base, as cisplatin do.

    The effect generated by free ligands and their Pt(II) complexes in the tertiary structure of pBR322 DNA has been determined by agarose gel electrophoresis and atomic force microscopy (AFM). Generally, the free ligands studied generate an increase of DNA aggregation and a slight coiling of the double helix, due to their possibility of forming hydrogen bonds with the DNA bases through different functional groups of their structure. The Pt(II) complexes generate an important coiling and aggregation of DNA, probably due to the covalent binding Pt-DNA and hydrogen bond interactions through their ligands.

    The cytotoxic activity of the Pt(II) complexes has been evaluated through cell proliferation assays in A431, HeLa and HL-60 cell lines using different incubation times (24h, 48h, 72h). The water-soluble complexes, PtCl2(Hdap), PtCl2(Hdab), PtCl2(dap-ala), PtCl2(dab-ala), PtCl2(dap-phe) i PtCl2(dab-phe), show antitumor activity in a dose- and time- dependent manner, gradually decreasing the cell survival percentage when the complex concentration increase, in the same direction as carboplatin. All these complexes present the highest activity at long incubation times and high complex concentration. The alanine complexes, PtCl2(dap-ala) and PtCl2(dab-ala) are the most active and those of phenylalanine are the less active, probably due to the ligand size, which can make its transport through cell membrane more difficult.

    The water-insoluble complexes, PtCl2(Etdap) and PtCl2(Etdab), apparently do not show antitumor activity due to the presence of 12% DMSO necessary por solving these complexes. In these conditions they do not cause a decrease in cell survival. The DMSO could interact with platinum, displacing the labile ligands of the complex and not allowing it to interact with DNA. Complex PtCl2(dap-ASTTTNYT-NH2) is also insoluble in water, but can be dissolved in 2% DMSO solution. Cell proliferation assays show that the free peptide, ASTTTNYT-NH2, and the platinum complex are both active. The activity of the complex is higher than the free peptide, probably because platinum can covalently interact with DNA and increase the cytotoxic effect. This result suggest that the ligand can act as a carrier ligand and make the interaction metal-DNA be easier.

    Flow cytometry assays have demonstrated that cell death generated by the complexes synthesized is apoptosis. Agarose gel electrophoresis of extracted DNA show a classical 200-base pair integer oligonucleosome ladder.

    A new trinuclear Pt(II) complex, {[Pt(Me2Bpy)2][PtCl2(Me2Bpy)]2} being Me2Bpy= 4,4-dimethyl-2,2-dipyridyl, has been synthesized and characterized. The X-ray diffraction of its structure shows the existence of an intramolecular Pt-Pt interaction of 3.474 Å.