Identificació i caracterització de nous factors associats als elements insulator de Drosophila melanogaster

• Autores: Sergi Cuartero Betriu
• Directores de la Tesis: Montserrat (Corominas Guiu) Corominas (dir. tes.), Mª Lluïsa Espinós Janer (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2013
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Emili Saló i Boix (presid.), Lluís Montoliu i José (secret.), Elena Casacuberta Suñer (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Genética
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Dipòsit Digital de la UB
• Resumen

  • Els elements insulator són seqüències al genoma que aïllen i separen regions reguladores. Clàssicament han estat definits per presentar dues propietats característiques: d’una banda són capaços d’aïllar un transgèn dels efectes posicionals de l’entorn cromosòmic —com mantenir-lo aïllat dels efectes silenciadors si el transgèn està situat en una regió heterocromàtica—, i per altra són capaços d’impedir l’activació d’un promotor per part d’un enhancer si l’insulator es troba entremig de tots dos (enhancer-blocking). A la regió reguladora del gen homeòtic Abdominal-B s’hi troben alguns dels insulators més ben estudiats de Drosophila melanogaster (Mcp, Fab-7 o Fab-8) que separen dominis reguladors (cadascun dirigint l’expressió d’Abdominal-B en un segment diferent). Al laboratori s’havien identificat prèviament zones d’hipersensibilitat a DNAsaI entre els dominis iab-5 i iab-6. Nosaltres hem les hem caracteritzat i n’hem identificat una (Fab-6) com a insulator, i que a més també té propietats de PRE (Polycomb response element). El Fab-6, situat en un transgèn entre un enhancer i un gen mini-white, atenua l’efecte activador de l’enhancer sobre el promotor. La manca de CP190 (proteïna necessària pels insulators) fa disminuir aquesta atenuació, demostrant que l’efecte és degut a una seqüència insulator. També hem demostrat que el Fab-6 es transcriu malgrat no ser codificant, i ho fa en el mateix sentit que el gen al qual regula, Abdominal-B. En canvi aquesta transcripció no té lloc en cèl•lules on Abdominal-B està silenciat. Hem vist que l’efecte enhancer-blocking d’alguns insulators també disminueix en mosques mutants de JIL-1. JIL-1 és una quinasa que fosforila la serina 10 de la histona H3 a interfase i que està relacionada amb activació de la transcripció i amb cromatina localment descondensada. Així, la participació de JIL-1 en l’activitat insulator pot venir donada per la necessitat d’aquests de transcriure’s. Per tal d’identificar més proteïnes que puguin estar involucrades en l’activitat insulator vam realitzar una purificació del complex format per CP190. CP190 és una proteïna que es troba a la major part d’insulators identificats fins el moment, i que és comú a tot els tipus d’insulator de Drosophila. Un cop purificat el complex en vam analitzar els components per espectrometria de masses. Entre les proteïnes identificades amb més robustesa hi havia les proteïnes ja conegudes d’insulator (CTCF, Su(Hw), Mod(mdg4)). Hi havia també altres proteïnes ja conegudes però fins ara no relacionades amb CP190 com Nurf-38 (component del complex remodelador de la cromatina NURF) i Z4 (relacionada amb manteniment de l’estructura de la cromatina, amb regions eucromàtiques i amb JIL-1). I també vam identificar dues proteïnes no descrites fins al moment que hem anomenat Ibf-1 i Ibf-2 per Insulator Binding Factor 1 i 2. Vam veure que es tractava de proteïnes amb localització nuclear i que s’unien a la cromatina a cromosomes politènics formant un patró de bandes que es solapa majoritàriament amb bandes de CP190. N’hem realitzat ChIP-seq (immunoprecipitació de cromatina seguida de seqüenciació) i hem observat que no només colocalitzen a la cromatina amb CP190 sinó també —tot i que amb menor mesura— amb les demés proteïnes d’insulator conegudes a Drosophila: Su(Hw), CTCF i BEAF. Els llocs d’unió mostren força diversitat: des de regions intergèniques a promotors de gens i també a introns i exons. Hi ha un particular enriquiment a gens que contenen promotors alternatius i a promotors que tenen un altre promotor proper. A nivell funcional hem vist per microarray que la seva manca causa desregulació de l’expressió de varis gens no relacionats funcionalment entre si. També hem vist en assaigs transgènics que la manca d’Ibf-1 i Ibf-2 disminueix l’efecte enhancer-blocking d’alguns insulators. Per tot plegat concloem que hem identificat dues noves proteïnes d’activitat insulator a Drosophila.