Gene expression reprogramming during the formation of feeding sites induced by plant endoparasitic nematodes
- Autores: Javier Cabrera Chaves
- Directores de la Tesis: Carolina Escobar de Lucas (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2016
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carmen Fenoll (presid.), Luis Eduardo Hernández Rodríguez (secret.), Bruno Hugues Favery (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: RUIdeRA
- Resumen
Los nematodos parásitos de plantas constituyen una de las principales plagas para la agricultura, causando pérdidas en la producción estimadas en un 12-15% a nivel mundial cada año. Entre ellos, los nematodos endoparásitos sedentarios, establecen una relación altamente sofisticada con la planta, induciendo sus propias células de alimentación en el interior de las raíces, las células gigantes (CGs) y los sincitios en el caso de los nematodos formadores de agallas o formadores de quistes, respectivamente. En el caso de los nematodos formadores de agallas del género Meloidogyne spp., el estadio de vida libre, juveniles (J2), penetran en la raíz por la zona subapical y migran intercelularmente hacia el ápice radicular donde giran para introducirse en el cilindro vascular. Una vez en el cilindro vascular, el nematodo se establece y selecciona entre 5 y 8 células para diferenciarlas en sus células alimentación, las CGs. Las CGs son de un tamaño alrededor de cien veces mayor a sus células vecinas del cilindro vascular. Son células de transferencia que actúan como sumidero de nutrientes de la planta para alimentar al nematodo, causando síntomas como enanismo o marchitamiento en la parte aérea de las plantas. El objetivo general de esta tesis fue el de entender los cambios en las expresión génica que permiten la diferenciación de células vasculares de la raíz en células altamente especializadas como las CGs. Con este objetivo, en nuestro grupo de investigación se obtuvieron previamente los transcriptomas de los sitios de alimentación (las CGs microdiseccionadas por láser y las agallas) inducidas por M. javanica en dos plantas modelos como Arabidopsis thaliana y tomate. Durante la realización de esta tesis se realizó el estudio comparativo de estos transcriptomas. En primer lugar, pudimos observar en ambas especies que los transcriptomas de las CGs y de las agallas son muy diferentes ya que la mayoría de los genes diferencialmente expresados en CGs no se encuentran diferencialmente expresados en las agallas que contienen estas CGs, reforzando la idea de la necesidad del estudio de estas células de alimentación aisladas del resto de tejidos para conocer sus marcas moleculares. Cuando realizamos un estudio de expresión diferencial de los transcriptomas de CGs en un estadio temprano de desarrollo, 3 días post- infección, observamos una masiva represión génica en ambas especies. Además, en un análisis de ortología con un blast recíproco, pudimos observar que esta represión génica parece estar conservada en ambas especies, pudiéndose detectar más de cien genes con posibles ortólogos, reprimidos ambos en las CGs de las dos especies por sólo un gen comúnmente inducido. Entre los genes comúnmente reprimidos se encuentran significativamente enriquecidos aquellos que codifican genes de defensa, enzimas del metabolismo secundario o peroxidasas. Entre estas peroxidasas, el gen TPX1 reprimido en las CGs de líneas susceptibles de tomate y en sus agallas, mientras que está altamente inducido en agallas de plantas resistentes. Además, la sobreexpresión de esta peroxidasa en la línea susceptible conlleva una reducción en los parámetros de infección y en el tamaño de las CGs desarrolladas. Parece por tanto que esta masiva represión génica en los sitios de alimentación de los nematodos, pueda tener un papel relevante para el correcto desarrollo de la infección. Muchos mecanismos de represión de genes están mediados por small RNAs (sRNAs), por ello, se estudió la regulación y el posible papel de los RNAs de pequeño tamaño (sRNAs) en la masiva represión génica encontrada en CGs. Se generaron seis librerías de sRNAs que se secuenciaron, tres de ellas muestras independientes de agallas a 3 días post infección y las otras tres de segmentos de raíces control. Las principales diferencias se encontraron en las secuencias de 21 y 24 nucleótidos, correspondientes a miRNAs y rasiRNAs respectivamente. En el primer caso, tras un análisis de expresión diferencial, se obtuvieron 51 mRNAs reprimidos y 11 inducidos. Entre los inducidos se encontraba el miRNA390a, que en colaboración con otro sRNA intermediario, el tasiRNA3a, participa en la cascada de señalización mediada por auxinas para la formación de las raíces laterales. Mediante el uso de líneas delatoras y líneas sensoras, líneas con pérdida de función, PCR cuantitativa y ensayos de infección, pudimos demostrar que ambos sRNAS, el miRNA390a y el tasiRNA3a, se encontraban inducidos y eran funcionales en las agallas y CGs inducidas por M. javanica, ya que líneas de pérdida de función tenían reducidos los índices de infección y el tamaño de las CGs era menor que en las líneas control. Tras esta masiva generación de datos mediante estudios holísticos, decidimos crear una base de datos de los transcriptomas de los sitios de alimentación de nematodos fitoendoparásitos inducidos en Arabidopsis a la que llamamos “NEMATIC”. Además, añadimos otras bases de datos y otros transcriptomas de relevancia para el estudio de esta interacción con el fin de facilitar la selección de genes para posteriores estudios funcionales. NEMATIC se usó para la comparación de los genes inducidos en CGs y agallas con aquellos enriquecidos en los diferentes tipos celulares de la raíz. Se observó un enriquecimiento de los genes característicos de tipos celulares indiferenciados de la raíz como el centro quiescente o las células fundadoras del periciclo asociado al xilema que originan los primordios de raíz lateral. Pudimos demostrar que uno de los genes marcadores de estas células fundadoras, el LBD16, se induce específicamente en las agallas inducidas por el nematodo y por sus secreciones. Además, líneas mutantes para este gen mostraron una reducción en el índice de infección y en el tamaño de las CGs. Sin embargo, LBD16 no se induce en los sincitios inducidos por nematodos formadores de quistes de la especie Heterodera schachtii. Por último, hemos desarrollado un nuevo método de fenotipado en las CGs mediante reconstrucción tridimensional. Tras seccionar una agalla completamente y tomar fotografías de todas las secciones seriadas, se utilizó el programa TrakEM2 para la alineación, por rotación y traslación, de las secciones y el posterior marcaje individual de cada CG. Esto nos permitió obtener reconstrucciones 3D de las CGs, observando por primera vez su morfología. Esto nos ha permitido obtener datos cuantitativos de los volúmenes ocupados por CGs individuales y por todo el grupo de células en el interior de una agalla. A este respecto, observamos que el parámetro más relevante con una alta correlación con los tiempos de infección, es precisamente el volumen de todo el pool de células en la agalla. Además, proponemos su utilidad para evitar errores en el fenotipado de las mismas en cuanto a su número y posición debido a su morfología irregular. Como conclusiones de esta tesis, hemos mostrado la existencia de una represión génica masiva en las CGs, conservada entre especies y necesaria para la progresión de la infección de los nematodos formadores de agallas Esta represión está mediada en parte por miRNAs y tasiRNAs y posiblemente por rasiRNAs. Además, mostramos la importancia de las divisiones de las células fundadoras del periciclo para la formación de las CGs y las agallas, y el importante papel del LBD16 y del miRNA390a en este proceso. Todo ello indica un paralelismo con la ruta mediada por auxinas para la formación de la raíz lateral. También propusimos un método de fenotipado estandarizado para evaluar el tamaño de las CGs.
