Resumen de Implicació dels lisosomes en la mort cel·lular per inhibició de la síntesi de fosfatidilcolina i en la senyalització de calci per NAADP
Miquel Barceló Torns
La fosfatidilcolina (PtdCho) és el fosfolípid majoritari de les membranes cel·lulars. La inhibició de la seva síntesi ha estat relacionada amb la mort cel·lular apoptòtica, que ha estat estudiada principalment mitjançant inhibidors farmacòlogics. La manca d'especificitat dels inhibidors utilitzats ha posat de relleu la necessitat d'utilitzar un model cel·lular on només la via de síntesi de PtdCho estigui afectada. La línia cel·lular CHO-MT58 presenta una mutació termosensible en l'enzim CTP:fosfocolina citi¬dililtransferasa (CCT), enzim regulador de la síntesi de PtdCho.Quan es cultiven les cèl·lules CHO-MT58 a 40ºC, observem una ràpida inhibició de la síntesi de PtdCho, un descens del contingut cel·lular de PtdCho i la pèrdua de viabilitat cel·lular en una seqüència temporal definida. La mort cel·lular produïda per la inhibició de la síntesi de PtdCho en cèl·lules CHO-MT58 genera poca condensació de la cromatina i fragmentació del DNA i no hi ha activació de caspasa-3 si es compara amb la mort apoptòtica induïda pel tractament amb Actinomicina D (ActD). A més, en la inhibició de la síntesi de PtdCho en cèl·lules CHO-MT58 es produeix en paral·lel un increment de la catepsina D i l'aparició de vesícules autofàgiques identificades en el microscopi electrònic de transmissió. Quan seguim el procés de l'autofàgia amb el marcador LC3 podem observar que l'aparició del fragment LC3-II, indicatiu de la presència d'autofagosomes, no disminueix al llarg dels temps a 40ºC suggerint un bloqueig de l'autofàgia causat per la inhibició de la síntesi de PtdCho en cèl·lules CHO-MT58.Per tant, la inhibició de la síntesi de PtdCho en cèl·lules CHO-MT58 a 40ºC provoca mort cel·lular no apoptòtica tot aturant l'autofàgia que actuaria com a mecanisme constitutiu de supervivència. Addicionalment, les catepsines actuarien com a possible mecanisme alternatiu de mort cel·lular.D'altra banda, actualment es sap que els astròcits tenen un paper importantíssim en la regulació de la transmissió sinàptica i en la plasticitat neuronal. Aquestes noves funcions dels astròcits són possibles perquè són cèl·lules excitables, tot i que la seva excitabilitat no es basa en potencials d'acció sinó en ones de Ca2+ intra- i intercel·lulars. Els mecanismes que controlen la senyalització via Ca2+ en astròcits, però, no es coneixen del tot. El nostre projecte ha demostrat que les vesícules acídiques de tipus lisosomals (VAL) són reservoris intracel·lulars de Ca2+ i el NAADP és un segon missatger capaç d'alliberar-ne el Ca2+ en astròcits corticals. Així hem determinat nivells endògens de NAADP i que aquests s'incrementen després d'estimulació amb diferents agonistes. Per altra banda, el NAADP-AM, un anàleg del NAADP permeable a la membrana plasmàtica, és capaç d'induir respostes de Ca2+ a diferents concentracions a través de l'alliberament de Ca2+ de les VAL en forma de campana (inhibició a altes concentracions de NAADP-AM). A més, hem demostrat l'expressió del receptor de NAADP en vesícules acídiques de tipus lisosomal. Per altra banda, la inhibició dels receptors de NAADP amb Ned-19 i la destrucció de les VAL amb GPN inhibeixen en part les respostes de calci induïdes per ATP, Endotelina-1 (ET-1) i Acetilcolina (Ach) però no per Bradiquinina. Finalment, el NAADP i les VAL també tenen un paper en l'excitabilitat astrocitària en la modulació de la magnitud de les ones de Ca2+ entre astròcits induïdes per estrès mecànic. Per tant, podem concloure com l'excitabilitat i senyalització via Ca2+ dels astròcits és un fenomen complex en el qual participen rutes de senyalització clàssiques (IP3 i ER; cADPR i RyR) però també nous segons missatgers i reservoris intracel·lulars de calci com ara el NAADP i les VAL.
