Resumen de Identificació de noves funcions de les proteïnes cinases Pkh en el llevat Saccharomyces cerevisiae
Anna Bahi Salavedra
L’activitat Pkh resulta essencial pel creixement vegetatiu del llevat Saccharomyces cerevisiae i es proporcionada principalment per Pkh1 i Pkh2. Es desconeixen però, en gran mesura, tant la totalitat de les seves funcions cel·lulars com els mecanismes de regulació. Amb l’objectiu d’estudiar les funcions de les proteïnes Pkh en llevat, els diferents grups d’investigació han utilitzat fins a dia d’avui una única aproximació consistent en l’eliminació del gen PKH2 i la substitució de PKH1 per una versió que codifica una proteïna l’activitat de la qual resulta suprimida a 37 ºC. L’ús d’aquesta estratègia implica un estrès tèrmic per les cèl·lules de llevat, les quals responen activant la via de la CWI, on es troba implicada la via Pkh-Pkc1-MAPK. És per aquesta raó que en aquest treball s’ha utilitzat una estratègia diferent, desenvolupada al laboratori, la qual consisteix en l’obtenció d’una soca mutant en la que se li han suprimit els gens PKH1 i PKH3 i en la que s’ha col·locat un promotor regulable per doxiciclina que controla l’expressió de PKH2. Gràcies a aquesta soca hem pogut verificar per primera vegada que les proteïnes Pkh són necessàries per la fosforilació de Slt2 en front a diversos estressos de paret cel·lular. A més, s’han estudiat els canvis a nivell transcripcional provocats per la manca de les proteïnes Pkh, revelant que es produeix una resposta característica d’una situació d’estrès oxidatiu. En efecte, les cèl·lules sense activitat Pkh acumulen més ROS i aquest fet va acompanyat d’un procés de mort cel·lular programada independent de la metacaspasa del llevat Mca1, segons els anàlisis de TUNEL que s’han realitzat. Els fenotips d’estrès oxidatiu i mort cel·lular es veuen disminuïts en part, per l’activació de la via MAPK de Slt2 mitjançant l’expressió d’una versió constitutivament activa de la MAPKK Bck1 . Quelcom que afegeix complexitat a la regulació d’aquesta família de cinases, és el fet que alguns esfingolípids de cadena llarga o esfingolípids complexos de llevat, podrien regular la via de senyalització de Pkh1. Es coneix que les proteïnes Pkh tenen, a diferència de PDK1, un domini C-terminal molt més extens, de funció desconeguda, sense el domini PH, essencial per la unió de PtdIns(3,4,5)P3 en mamífers (que no sintetitza el llevat). Amb l’objectiu d’estudiar-ne la funcionalitat, s’han generat soques haploides on l’única activitat Pkh ve proporcionada per un plasmidi que porta la versió sencera de Pkh1 o bé una versió sense el domini C-terminal. Gràcies a aquestes soques hem identificat l’esfingolípid sulfàtid, no descrit en llevats, capaç d’unir-se específicament als últims 100 aa del domini no catalític de Pkh1. Aquest fet ens ha portat a estudiar el lipidoma del llevat, el qual s’ha separat per la tècnica de HPTLC, que ens ha permès identificar una fracció polar del lipidoma que s’uneix a Pkh1. A més hem determinat que el domini C-terminal de Pkh1 és responsable de la sensibilitat als inhibidors de la síntesis dels esfingolípids, indicant així que els esfingolípids podrien tenir un paper en l’activació de les proteïnes Pkh. A partir d’un assaig cinasa fet amb liposomes que contenen sulfàtid, hem vist que la unió amb sulfàtid té una efecte negatiu sobre la capacitat de Pkh1 de fosforilar el substrat PKB?PH, a diferència de l’assaig realitzat amb liposomes que contenen la fracció polar del lipidoma, que no en modifiquen l’activitat.
