Caracterización Genética y Funcional de la Proteína ns P1a/4 de Astrovirus Humano

• Autores: Cristina Fuentes Pardo
• Directores de la Tesis: Rosa María Pintó Solé (dir. tes.), Susana Guix Arnau (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2013
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Javier Buesa Gómez (presid.), Ana Angulo Aguado (secret.), Juana Díez Antón (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Virología
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Microbiología clínica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • Los astrovirus humanos son virus de gastroenteritis infantiles y tienen un genoma RNA monocatenario de polaridad positiva organizado en tres pautas abiertas de lectura (ORF1a y ORF1b para las proteínas no estructurales, y ORF2 para las proteínas estructurales). Actualmente se desconoce la función de muchas de sus proteínas no estructurales. No obstante, en la región C-terminal de la poliproteína nsP1a codificada por el ORF1a (denominada nsP1a/4) se han descrito multitud de motivos que podrían tener una función biológica relevante para su ciclo replicativo. Entre otros, cabe destacar la presencia de una región hipervariable (HVR), que se ha relacionado con un posible papel en la replicación del RNA vírico, y una putativa región codificante para una proteína VPg. Bajo estas premisas los objetivos de esta tesis fueron profundizar en la caracterización de la proteína nsP1a/4 tanto a nivel de variabilidad genética como a nivel funcional y confirmar experimentalmente la existencia de una VPg unida covalentemente al genoma vírico. El análisis de la HVR de la proteína nsP1a/4 mostró un grado elevado de variabilidad, sobre todo a nivel de aminoácidos, con una buena tolerancia a las inserciones y deleciones y a los cambios no sinónimos. Por otro lado, el análisis filogenético de la HVR de 104 aislados permitió la identificación de 12 genotipos diferentes y el análisis de la carga vírica excretada en muestras clínicas correspondientes a distintos genotipos derivados de la HVR mostró una correlación significativa entre estos dos parámetros. Aprovechando la variabilidad de esta región del genoma de astrovirus, se desarrolló también un método de tipado molecular por amplificación por RT-PCR y análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Con el fin de profundizar en la caracterización de la proteína nsP1a/4 y establecer posibles diferencias funcionales entre genotipos, se clonaron y expresaron en el sistema de baculovirus varias formas de la proteína correspondientes a los genotipos IV, V, VI y XII. Así, para todos los genotipos estudiados, se observó que existen diferentes isoformas de la proteína, una isoforma no fosforilada y diferentes isoformas fosforiladas, y que las isoformas no fosforiladas interaccionan entre sí formando oligómeros. Además, dada la implicación de la proteína nsP1a/4 en el proceso de replicación del RNA, se estudió la potencial interacción de la proteína nsP1a/4 con la polimerasa vírica. Para todos los genotipos estudiados, se observó que la proteína nsP1a/4 interacciona con la polimerasa formando un heterodímero. En cuanto a la forma de la nsP1a/4 que interacciona con la polimerasa, los resultados mostraron que lo hacen tanto la isoforma no fosforilada como la fosforilada, si bien en este caso sí que se observaron diferencias entre los distintos genotipos. Concretamente, la isoforma fosforilada de la proteína nsP1a/4 correspondiente al genotipo VI presentó un patrón de interacción más fuerte con la polimerasa en comparación con la isoforma no fosforilada. En cuanto a la existencia de una proteína VPg, el análisis de las proteínas co-purificadas con el RNA de astrovirus reveló la presencia de una proteína con un peso molecular (13-15 kDa) compatible con el de la VPg predicha computacionalmente. La identificación de un péptido de 15 aminoácidos confirmó que la región codificante para la VPg se localiza dentro de la región codificante para la proteína nsP1a/4 y el tratamiento proteolítico del RNA de astrovirus con Proteinasa K demostró que dicha proteína resulta esencial para la infectividad del virus. Finalmente, el uso de distintas formas mutadas de la VPg permitió identificar el residuo Tyr693 como potencial residuo de unión al RNA. Así pues, la mejor caracterización de las proteínas nsP1a/4 y VPg de astrovirus proporciona las bases para su posible aplicación en el futuro como nuevas dianas antivíricas.