Desarrollo, optimización y evaluación de nuevos métodos inmunológicos y moleculares en el diagnóstico de las infecciones causadas por Legionella pneumophila

• Autores: Silvia Blanco Palencia
• Directores de la Tesis: José Antonio Domínguez Benítez (dir. tes.), Vicente Ausina Ruiz (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2010
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jordi Roig Cutillas (presid.), Montserrat Giménez Pérez (secret.), R. Araujo (voc.)
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Microbiología clínica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • Legionella se identificó por primera vez en 1976. Es una bacteria ampliamente distribuida en la naturaleza, siendo su nicho natural el medio acuático. Es responsable del 3-15% de las neumonías adquiridas en la comunidad y es, asimismo, causa frecuente de neumonía intrahospitalaria. En primer lugar, se han evaluado nuevas técnicas de detección de antígeno y al comparar los resultados de la técnica EIA de Bartels con el EIA de Binax, hemos observado que la sensibilidad en muestras de orina no concentrada es mayor con esta nueva técnica sin deterioro de la especificidad. En el caso de la orina concentrada, ambas técnicas muestran una elevada sensibilidad y un 100% de especificidad, ofreciendo por lo tanto una alternativa al EIA Binax cuando se realiza en orina no concentrada. En el caso de la ICT Uni-Gold LUA es también una alternativa en el diagnóstico de la legionelosis, reduciendo el tiempo si lo comparamos con las técnicas de EIA y con unos resultados comparables a la ICT de Binax. Recientemente, se ha podido evaluar una segunda versión de esta nueva ICT (Uni-Gold LUA plus) que ofrece unos valores de sensibilidad y especificidad iguales a la ICT de Binax tanto en orina no concentrada como en orina concentrada. En segundo lugar se han estandarizado técnicas de concentración. El tiempo necesario para concentrar una muestra de orina, para la posterior detección de antígeno por ultrafiltración pasiva es de 1 a 3 horas, por ese motivo evaluamos una nueva técnica de concentración por centrifugación disminuyendo el tiempo a unos 15-20 minutos. La concordancia global entre las dos técnicas de concentración fue del 100%. Este sistema permite reducir drásticamente el tiempo en el diagnóstico de la legionelosis mediante detección de antígeno.Al utilizar el EIA de Binax para cuantificar la concentración de antígeno presente en las muestras de orina de pacientes con legionelosis hemos observado que en los pacientes en que se resolvió completamente la neumonía la cantidad de antígeno presente en orina disminuyó significativamente a los 3-6 días respecto a la concentración de antígeno presente en el momento del ingreso (p<0.0001). En cambio en los pacientes con peor evolución y en aquellos que fallecerion la disminución de carga antigénica en orina no fue significativa. Los resultados de este estudio sugieren una correlación entre una mayor concentración de antígeno y una peor evolución de los pacientes. En esta tesis, también se incluye la evaluación de una técnica inmunológica de detección de antígeno en muestras ambientales para su utilización en el cribaje medioambiental. Se estudiaron muestras de agua artificiales en las que se inoculó Legionella y muestras de agua procedentes de sistemas de agua doméstica y de torres de refrigeración. En nuestro estudio, en las muestras de agua artificial el EIA de Bartels fue capaz de detectar antígeno de todos los serogrupos, aunque mostró una mayor sensibilidad para L. pneumophila serogrupo 1. El límite de detección en agua artificial para el serogrupo 1 fue de 780 ufc/ml en el agua original antes de la filtración. Dado que los brotes de legionelosis suelen ir vinculados a una amplificación de los niveles de Legionella en los sistemas de agua y que durante un brote son necesarias una rápida identificación y descontaminación del sistema de agua colonizado, la detección de antígeno mediante EIA podría ser útil como un método rápido de cribado para analizar un alto número de muestras.Finalmente, la tesis se completa con la evaluación de técnicas de secuenciación para la identificación a nivel de especie del género Legionella y de tipaje molecular intraespecífico. El objetivo del estudio fue optimizar la identificación de cepas de Legionella mediante la secuenciación del gen mip. Los resultados obtenidos muestran que la identificación de Legionella spp. mediante la secuenciación de este gen es una técnica sólida, y que la mayoría de los laboratorios son capaces de reproducir y de dar un resultado correcto. Actualmente, la necesidad de disponer de métodos de caracterización molecular que ofrezcan resultados rápidos y reproducibles, con la posibilidad de ser compartidos en tiempo real por diferentes laboratorios, ha llevado al desarrollo de métodos de secuenciación de genes basados en técnicas de MLST y ha sido empleada para la tipificación molecular de L. pneumophila serogrupo 1. Los resultados obtenidos con el estudio de seis genes, flaA, pilE, asd, mip, mompS y proA, son muy prometedores.